脐带间充质干细胞外泌体递送circRNA＿0001454通过miR-9-5p/SIRT1抑制自噬减轻急性呼吸窘迫综合征

摘要

目的 探讨脐带间充质干细胞(MSC)外囊泡(EV)携带的circRNA＿0001454调控急性呼吸窘迫综合征(ARDS)肺泡上皮细胞自噬的相关机制。方法 采用组织块贴壁法分离培养新疆医科大学第二附属医院2024年1—12月出生的足月新生儿脐带中MSC并进行鉴定。超速离心法分离获取EV;采用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术和Western-blot法对EV进行鉴定。实验选择人肺泡上皮细胞(HPAEpiC),采用脂多糖刺激HPAEpiC 12 h构建ARDS体外细胞模型。实验分为6组，分别为对照组、MSC-EV+模型组(MSC-EV组)、模型组、空载体组、过表达组和低表达组。除了对照组，其他各组均复制模型，空载体组、过表达组和低表达组分别将携带空载体、circRNA＿0001454过表达组与低表达质粒载体的MSC-EV与HPAEpiC共培养24 h。激光共聚焦显微镜观察HPAEpiC对MSC-EV的摄入情况，qRT-PCR检测circRNA＿0001454和miR-9-5p; Westernblot检测沉默信息调节因子1(SIRT1)蛋白；CCK-8检测细胞活力；TUNEL染色检测细胞凋亡；透射电镜观察自噬体的形成；Western blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II与I比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1和自噬相关蛋白5(ATG5); ELISA检测上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6。通过生物信息学和双荧光素酶检测实验验证circRNA＿0001454与miR-9-5p的靶向关系。结果 成功分离鉴定出MSC和EV。HPAEpiC成功摄入MSC-EV, MSC-EV组较对照组HPAEpiC中circRNA＿0001454表达量增加，而模型组与对照组比较无显著差异。过表达组HPAEpiC中miR-9-5p和SIRT1蛋白表达量较空载体组和模型组显著降低，而低表达组miR-9-5p和SIRT1蛋白表达量较空载体组和模型组显著增加(P<0.05),提示circRNA＿0001454可以抑制miR-9-5p和SIRT1蛋白表达。过表达组较空载体组和模型组细胞活力显著增加，细胞凋亡率、自噬体形成、LC3-II/LC3-I、Beclin-1和ATG5表达以及TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低；低表达组较空载体组和模型组细胞活力显著降低，细胞凋亡率、自噬体形成、LC3-II/LC3-I、Beclin-1和ATG5表达以及TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著增加(P<0.05)。生物信息学显示circRNA＿0001454与miR-9-5p存在结合位点，双荧光素酶报告实验结果及PCR显示circRNA＿0001454靶向调控miR-9-5p表达。结论 MSCEV携带的circRNA＿0001454可能通过吸附miR-9-5p抑制SIRT1通路减轻ARDS肺泡上皮细胞的自噬水平。

关键词

间充质干细胞 / 外泌体 / 环状RNA＿0001454 / 急性呼吸窘迫综合征 / 自噬 / 微小RNA-9-5p / 沉默信息调节因子1 / 外囊泡

基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2022D01C498)