LncRNA GSEC调控CTCF促进布鲁氏菌性脊柱炎巨噬细胞极化的机制研究

摘要

目的 探讨长链非编码核糖核酸(LncRNA)G-四链形成序列(GSEC)在布鲁氏菌性脊柱炎(BS)中的作用及其对BS巨噬细胞极化的调节机制。方法 选取2021年5月—2024年5月收治的36例初诊BS患者及同期体检的30名健康人员为研究对象，采集所有受试者静脉血备用。人单核细胞(THP1)经培养后分组：对照组[细胞培养基中加入5%健康人群血清及50 ng/mL佛波酯(PMA)分化48 h]、BS组(细胞培养基中加入5%BS患者血清及50 ng/mL PMA分化48 h)、sh-NC组(转染对照载体sh-NC)、sh-GSEC组[转染含LncRNA GSEC的shRNA(sh-GSEC)慢病毒载体]、sh-GSEC+LV-NC组[转染含sh-GSEC的慢病毒载体与对照载体(LV-NC)]和sh-GSEC+LV-CTCF组[转染含sh-GSEC的慢病毒载体与含CCCTC结合因子(CTCF)过表达载体(LV-CTCF)的慢病毒载体]。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测各组转染分化的巨噬细胞中LncRNA GSEC及CTCF mRNA表达水平；蛋白免疫印迹(Western blot)分析各组CTCF蛋白表达情况；RNA免疫沉淀(RIP)测定LncRNA GSEC与CTCF结合情况；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测纳入者血清和各组细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-10和转化生长因子β(TGF-β)水平；流式细胞术分析各组M1型和M2型巨噬细胞比例。结果 BS患者外周血M1型巨噬细胞含量较健康人群上调，M2型巨噬细胞含量较健康人群降低，差异均有统计学意义(P<0.001)。ELISA显示，与健康人群比较，BS患者血清中促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平上调，抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β水平降低，差异均有统计学意义(P<0.001)。RT-qPCR结果显示，BS患者外周血中LncRNA GSEC表达水平为(4.05±0.26),高于健康人群的(1.02±0.11),差异有统计学意义(P<0.001)。RT-qPCR结果显示，sh-GSEC组细胞中LncRNA GSEC表达水平为(0.32±0.07)%,低于sh-NC组的(1.02±0.09)%,差异有统计学意义(P<0.001)。流式细胞术分析显示，sh-GSEC组M1型巨噬细胞含量较sh-NC组降低，M2型巨噬细胞含量升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。ELISA检测结果显示，sh-GSEC组巨噬细胞上清液中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平较sh-NC组降低，抗炎因子IL-4、IL-10、TGF-β水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot分析显示，BS患者外周血中CTCF蛋白表达水平较健康人群上调，差异有统计学意义(P<0.001)。RIP结果表明，CTCF抗体所捕获的复合物中LncRNA GSEC含量较IgG抗体捕获的复合物中更富集(P<0.001)。RT-qPCR结果显示，sh-GSEC+LV-CTC组巨噬细胞中CTCF mRNA表达水平为(3.53±0.47),较sh-GSEC+LV-NC组的(1.01±0.05)和sh-GSEC组的(1.02±0.04)升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示，sh-GSEC+LV-CTCF组巨噬细胞中CTCF蛋白水平为(3.12±0.27),较sh-GSEC+LV-NC组(1.03±0.06)和sh-GSEC组(1.01±0.04)升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术结果显示，sh-GSEC组M1型巨噬细胞含量较sh-NC组降低，M2型巨噬细胞含量升高，差异均有统计学意义(P<0.01); sh-GSEC+LV-CTCF组M1型巨噬细胞含量较sh-GSEC+LV-NC组升高，M2型巨噬细胞含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 LncRNA GSEC通过靶向调控CTCF表达，调节巨噬细胞向M1型极化，促进BS的发生，这为理解BS病机及开发新的诊断和治疗标志物提供了新方向。

关键词

布鲁氏菌性脊柱炎 / 长链非编码核糖核酸G-四链形成序列 / CCCTC结合因子 / 巨噬细胞 / 炎症因子 / RNA免疫沉淀 / 佛波酯 / 慢病毒载体

基金资助

内蒙古自治区自然科学基金项目计划(2020MS08164); 2021年巴彦淖尔市科技计划项目(K202139); 2021年巴彦淖尔市医院院内科研项目计划(2021003); 2024年巴彦淖尔市科技计划项目(KL2024062)