基于NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体信号筛选猴痘病毒调控炎症的关键蛋白

摘要

【目的】筛选并鉴定猴痘病毒（MPXV）调控NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体信号的关键蛋白。【方法】以MPXV国内流行毒株的基因组为模板，构建可能具有炎症调控功能的病毒基因表达质粒库（共82个）。将NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、含有荧光素酶报告基因的白细胞介素1β前体（pro-IL-1β-Luc）蛋白的真核表达质粒以及病毒基因表达质粒共转染HEK293T细胞，通过检测细胞上清液中的荧光素酶活性来监测NLRP3炎症小体信号通路的活化，从而筛选明显抑制成熟IL-1β产生的病毒基因，通过蛋白质印迹（WB）等方法进一步鉴定其抑制作用，通过免疫共沉淀（Co-IP）等方法鉴定其与NLRP3炎症小体各组分的相互作用，通过关键位点突变的方法鉴定其相互作用的基序。【结果】成功构建并优化了NLRP3炎症小体信号筛选体系，使用该体系筛选MPXV表达质粒库，其中B10R抑制成熟IL-1β产生的效果最为明显（P<0.000 1），其抑制作用呈现剂量依赖性，进一步鉴定发现B10R能够与pro-IL-1β结合，而B10R的C端基序突变体B10Rmut-C(T96A, Y97A, I98A)失去了与pro-IL-1β相互作用的能力。【结论】MPXV B10R蛋白能够与pro-IL-1β相互作用，进而抑制成熟IL-1β的产生，而B10R蛋白C端基序（T96, Y97, I98）对于其功能发挥至关重要。本研究为进一步解析MPXV调控NLRP3炎症小体信号的分子机制提供了线索和依据。

关键词

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 / 炎症小体 / 猴痘病毒 / 白细胞介素1β / B10R