匹维溴铵与苯唑西林联用对表皮葡萄球菌的协同抗菌作用

摘要

目的：表皮葡萄球菌能黏附于医疗器械表面形成高耐药的生物被膜，针对表皮葡萄球菌及其生物被膜的新型抗菌药物研发已成为研究热点。本研究通过药物重新利用，探讨L型钙离子通道阻断剂匹维溴铵（pinaverium bromide,PVB）与苯唑西林（oxacillin,OXA）联合使用对表皮葡萄球菌的抗菌作用。方法：表皮葡萄球菌临床菌株于2022年1至9月收集于中南大学湘雅三医院检验科。通过微量肉汤稀释实验检测PVB和OXA的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）。棋盘稀释实验和时间-杀菌曲线用于检测PVB和OXA联用的协同抑菌指数和协同杀菌效率。耐药筛选实验用于检测PVB抑制OXA耐药性形成的能力。生物被膜清除实验结合激光共聚焦显微镜观察和持留菌计数实验用于检测PVB与OXA联用对表皮葡萄球菌高耐药性生物被膜和持留菌的抗菌作用。通过透射电镜、活性氧（reactive oxygen species,ROS）定量实验和ATP定量实验探讨PVB的作用机制。结果：PVB和OXA对表皮葡萄球菌标准菌株RP62A的MIC均为8μg/mL。棋盘稀释实验显示PVB与OXA联用对表皮葡萄球菌标准菌株RP62A的协同抑菌指数为0.250 0，对临床分离菌株的协同抑菌指数为0.187 5～0.500 0，提示均为协同作用。耐药筛选实验发现PVB不仅不会产生耐药，还能有效抑制OXA产生耐药。1×MIC的PVB和OXA联用时，可使生物被膜的吸光度(A_{570 nm})从（2.36±0.46）减少到（1.12±0.39）(t=3.504,P=0.02)。通过激光共聚焦显微镜观察可知，PVB和OXA联用还可明显破坏生物被膜的结构，使死亡细菌的比例增加。同时，1×MIC的PVB和OXA作用于持留菌4 h，可使持留菌的总量从lg（7.73±0.21）减少到lg（2.79±0.43）(t=4.143,P=0.014)。此外，PVB联用OXA的协同抗生物被膜效果在临床菌株中得到进一步验证。透射电镜观察发现PVB可使细菌结构明显破坏。OXA与PVB联用可显著诱导细菌产生ROS，使ROS相对荧光强度从（30 000.00±2 000.00）升高到（45 666.67±2 081.67）(t=10.68,P<0.001)。PVB和OXA联用还可显著降低ATP的生成，使ATP探针相对荧光强度从（565.00±33.18）减少到（205.67±35.23）(t=4.932,P=0.003)。结论：PVB联用OXA对表皮葡萄球菌及其生物被膜和持留菌具有显著的协同抗菌作用，有望成为难治性表皮葡萄球菌生物被膜相关感染的替代药物。

关键词

匹维溴铵 / 苯唑西林 / 抗生素 / 协同作用 / 生物被膜