星形胶质细胞重编程多巴胺能神经元对帕金森病模型大鼠运动功能障碍的修复效应

摘要

目的：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种神经退行性变性疾病，其根本原因是患者脑内多巴胺能神经元(dopaminergic neuron,DA)的死亡。由于DA不可再生，传统治疗手段只能缓解PD的症状。本研究旨在通过将易于获得的星形胶质细胞(astrocyte,AS)重编程为DA后再移植入脑内，重建受损的神经通路，以达到治疗PD的目的。方法：从新生乳鼠脑组织中分离得到AS。构建携带转录因子核受体相关因子1(nuclear receptor-related factor 1,NURR1)和achaete-scute家族bHLH转录因子1(achaete-scute family bHLH transcription factor 1,ASCL1)的慢病毒载体LV-NURR1-ASCL1，用LV-NURR1-ASCL1感染体外培养的大鼠AS。采用免疫荧光技术、蛋白质印迹法、反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测并比较慢病毒感染后的AS(LV组)和未添加LV-NURR1-ASCL1的完全培养基中培养的AS(Con组)NURR1、ASCL1的表达水平。将慢病毒感染后的AS细胞置于神经元诱导培养基中培养18 d后，采用免疫荧光技术检测其是否表达DA标志物酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、叉头框蛋白A2(forkhead box A2,FOXA2)及神经元标志物β-微管蛋白III型(class III beta-tubulin,TUJ1)。予大鼠右脑内侧前脑束(medial forebrain bundle,MFB)区域2个位点注射6-羟基多巴胺(6-hydroxy-dopamine,6-OHDA)，以建立PD大鼠模型。将转分化后的细胞(AS-iDA)定量后通过立体定位仪移植入PD模型大鼠右脑MFB区域。移植后4周通过免疫荧光技术检测AS-iDA在PD大鼠脑内的存活、分化、迁移情况，以及PD大鼠大脑组织中TH、TUJ1、FOXA2的表达情况；移植8周后，通过阿扑吗啡(apomorphine,APO)诱导旋转实验、转棒疲劳实验和旷场实验检测移植后PD大鼠运动功能的恢复情况。结果：免疫荧光结果显示慢病毒感染后的AS中NURR1、ASCL1表达阳性。RT-PCR结果显示LV组AS中NURR1和ASCL1的mRNA表达量相较于Con组分别上升了(7.483±0.706)倍和(10.830±1.940)倍。蛋白质印迹法结果显示LV组NURR1和ASCL1的蛋白质表达量相较于Con组分别上升了(2.403±0.511)倍和(4.423±0.603)倍。将慢病毒感染后的AS定向诱导培养18 d后，细胞形态发生显著变化，衍生出神经元样的长突触，同时细胞高表达神经元标志物TUJ1，以及DA标志物TH、FOXA2。移植后4周的大鼠脑切片免疫荧光显示AS-iDA在移植区域存活并向周围迁移，表达TUJ1、TH及FOXA2；移植后8周时，相比于PD大鼠，移植AS-i DA后的PD大鼠APO诱导旋转实验中APO诱导的旋转圈数明显减少，旷场实验中的移动距离和转棒疲劳实验中的在棒时间均明显增加(均P<0.05)。结论：通过慢病毒感染过表达NURR1和ASCL1可高效诱导AS转分化为DA，移植转分化的DA可显著改善PD大鼠的运动功能，为神经退行性变性疾病的治疗提供了潜在的供体细胞。

关键词

星形胶质细胞 / 转录因子 / 多巴胺能神经元 / 帕金森病 / 细胞转分化