一种可电离阳离子脂质构建脂质体用于siRNA递送的体外研究

摘要

目的：干扰小RNA（small interfering RNA,siRNA）可通过序列特异性的RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默疾病相关基因的表达。含有阳离子脂质的脂质体能够有效地将核酸递送至胞质使其发挥作用，但毒性较大。本文旨在通过利用天然氨基酸合成一种新型可电离脂质——N^ε-月桂酰基赖氨酸酰胺（Nε-laruoyl-lysine amide,LKA）并构建脂质体，探究其理化性质的表征及细胞相关实验，系统评估这一新型可电离脂质构建的脂质体作为核酸递送系统的潜力。方法：采用化学法合成LKA，并通过核磁共振氢谱和质谱进行表征验证；采用纸电泳实验探究LKA的pH响应性电荷变化情况；采用乙醇注入法制备LKA构建的空白脂质体（Nε-laruoyl-lysine amide-Lipoprotein,LKA-LP）、包载信号转导及转录激活因子3-siRNA（signaltransducerandactivatoroftranscription3-siRNA, STAT3-siRNA）的脂质体（LKA-LP@STAT3-siRNA）和包载尼罗红的脂质体（LKA-LP@Nile Red）。采用激光粒度分析仪和扫描电子显微镜对LKA-LP@STAT3-siRNA进行粒径大小及形态表征检测；采用琼脂糖凝胶电泳法检测LKA-LP@STAT3-siRNA的包封率。采用LKA-LP@Nile Red考察人宫颈上皮癌细胞系HeLa细胞和小鼠胚胎成纤维细胞系3T3对于脂质体的摄取情况；采用花菁5（Cyanine 5,Cy5）标志STAT3-siRNA，结合溶酶体绿色荧光探针评价人肺腺癌上皮细胞系A549细胞中LKA-LP@STAT3-siRNA的溶酶体逃逸能力；采用实时反转录聚合酶链反应检测STAT3基因沉默效果；采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法测定LKA-LP@STAT3-siRNA对于HeLa细胞的杀伤作用。结果：核磁共振氢谱和质谱检测结果提示LKA合成成功。纸电泳实验结果显示从pH 7.4减小至pH 5.5的过程中，LKA的正电荷量逐渐增加。LKA-LP@STAT3-siRNA呈大小均匀的类球形，粒径为（164.1±3.27） nm，多分散性指数为0.174±0.029,7 d内可以保持较好的稳定性，核酸的包封率为（64.6±2.8）%。细胞摄取实验结果显示，与pH 7.4时比较，pH5.0时细胞对LKA-LP摄取增多，且与3T3细胞比较，HeLa细胞摄取增多更明显。溶酶体逃逸实验显示LKA-LP与溶酶体重叠率约为42.34%，证明LKA-LP可以顺利地从溶酶体逃逸。基因沉默实验结果显示，50和100 nmol/L的LKALP@STAT3-siRNA处理后，HeLa细胞中STAT3的mRNA相对表达水平均显著降低（均P<0.01）。细胞毒性实验结果显示，50和100 nmol/L的LKA-LP@STAT3-siRNA处理后，HeLa细胞存活率均显著低于3T3细胞（均P<0.01）。结论：可电离阳离子脂质LKA可构建脂质体LKA-LP以用于siRNA药物的递送。在细胞层面成功实现了基因沉默，且对HeLa细胞产生了特异性杀伤作用，为LKA-LP作为核酸递送载体的核酸药物的开发奠定了坚实且充足的基础。

关键词

干扰小RNA递送 / 可电离阳离子脂质 / 脂质体 / 化学合成 / HeLa细胞