LncRNA RP11-499E18.1对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响

Effects of lncRNA RP11-499E18.1 on the malignant biological behavior of ovarian cancer cells

摘要

目的 卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，晚期患者的预后较差。本研究筛选卵巢癌预后相关的差异表达长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNA)，并探究其对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。 方法 从基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库中获取卵巢癌相关lncRNAs数据集，并采用lncRNA测序结合GEO数据库中相关临床信息筛选潜在的肿瘤抑制lncRNA。采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测lncRNA RP11-499E18.1在卵巢组织及相应的癌旁组织、卵巢正常上皮细胞系IOSE80及卵巢癌细胞系中的表达情况；采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术检测lncRNA RP11-499E18.1在卵巢癌细胞中的定位。将卵巢癌细胞系CaOV3和SKOV3分为3组：阴性对照(negative control，NC)组、敲减(si-RP11-499E18.1)组和过表达(pcDNA-RP11-499E18.1)组。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)实验和Transwell实验分别检测lncRNA RP11-499E18.1对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响；采用蛋白质印迹法检测lncRNA RP11-499E18.1对卵巢癌细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关分子表达的影响。将BALB/c裸鼠小鼠分为实验组(注射转染pcDNA-RP11-499E18.1的CaOV3细胞)和对照组(注射转染空载体pcDNA的CaOV3细胞)。采用免疫组织化学法检测实验组和对照组卵巢癌组织中Caspase 3和Ki67的表达情况。 结果 LncRNA测序结果显示lncRNA RP11-499E18.1为与卵巢癌预后相关的差异表达lncRNA。对GEO数据库中相关临床数据进行分析，结果显示：与lncRNA RP11-499E18.1高表达的卵巢癌患者相比，lncRNA RP11-499E18.1低表达的卵巢癌患者的总生存期、无进展生存期更短(均P<0.05)。LncRNA RP11-499E18.1为潜在的肿瘤抑制lncRNA。LncRNA RP11-499E18.1在卵巢癌组织的表达明显低于癌旁组织(P<0.001)，在卵巢癌细胞系CaOV3、OVCAR3、SKOV3、A2780中的表达显著低于IOSE80(均P<0.001)，且lncRNA RP11-499E18.1在细胞核和细胞质中并存。在CaOV3和SKOV3细胞中，si-RP11-499E18.1组的细胞增殖率均显著高于NC组(均P<0.05)，pcDNA-RP11-499E18.1组的细胞增殖率均显著低于NC组(均P<0.001)；si-RP11-499E18.1组迁移的细胞多于NC组，pcDNA-RP11-499E18.1组迁移的细胞少于NC组；与NC组相比，pcDNA-RP11-499E18.1组细胞中EMT相关分子E-cadherin的蛋白质表达水平升高、vimentin表达降低，而si-RP11-499E18.1组E-cadherin表达降低、vimentin表达升高。实验组荷瘤小鼠的成瘤体积显著小于对照组(P<0.001)。实验组肿瘤组织中的细胞凋亡相关分子Caspase 3表达显著升高(P<0.05)，细胞增殖相关分子Ki67表达显著降低(P<0.05)。 结论 LncRNA RP11-499E18.1可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和EMT，且其低表达和卵巢癌不良预后相关。

Abstract

Objective Ovarian cancer is a common gynecologic malignancy, with poor prognosis in advanced stages. This study aimed to identify differentially expressed long noncoding RNA (lncRNA) associated with ovarian cancer prognosis and to explore the effects of lncRNA RP11-499E18.1 on the malignant biological behavior of ovarian cancer cells. Methods Ovarian cancer-related lncRNA datasets were obtained from the Gene Expression Omnibus (GEO) database. Differentially expressed and prognostically relevant tumor-suppressive lncRNAs were screened using lncRNA sequencing combined with clinical data. Reverse transcription PCR (RT-PCR) was used to detect the expression of lncRNA RP11-499E18.1 in ovarian cancer tissues, adjacent normal tissues, the IOSE80 normal ovarian epithelial cell line, and various ovarian cancer cell lines. Fluorescence in situ hybridization (FISH) was performed to determine its subcellular localization. Ovarian cancer cell lines CaOV3 and SKOV3 were divided into 3 groups: a negative control (NC) group, a knockdown (si-RP11-499E18.1) group, and a overexpression (pcDNA-RP11-499E18.1) group. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and Transwell assays were used to assess the effects of lncRNA RP11-499E18.1 on cell proliferation and migration. Western blotting was used to evaluate its effect on epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related molecules. BALB/c nude mice were injected with CaOV3 cells transfected with pcDNA-RP11-499E18.1 (experimental group) or empty vector (control group), and tumor growth was monitored. Immunohistochemistry was used to assess the expression of Caspase 3 and Ki67 in tumor tissues. Results LncRNA sequencing identified RP11-499E18.1 as a differentially expressed and associated with prognosis. GEO data analysis showed that low RP11-499E18.1 expression was correlated with shorter overall and progression-free survival (both P<0.05). Its expression was significantly lower in ovarian cancer tissues and cell lines compared to normal controls (P<0.05 or P<0.001), and it was localized in both the nucleus and cytoplasm. In CaOV3 and SKOV3 cells, proliferation rates increased significantly in the si-RP11-499E18.1 group and decreased in the pcDNA-RP11-499E18.1 group (P<0.05 or P<0.001). Cell migration was enhanced in the si-RP11-499E18.1 group and suppressed in the pcDNA-RP11-499E18.1 group. Overexpression increased E-cadherin and decreased vimentin expression, while knockdown had the opposite effect. Tumor volume in the mouse model was significantly smaller in the experimental group (P<0.001), with increased Caspase 3 and decreased Ki67 expression in tumor tissues (both P<0.05). Conclusion LncRNA RP11-499E18.1 inhibits proliferation, migration, and EMT of ovarian cancer cells, and its low expression is associated with poor prognosis.

Graphical abstract

关键词

卵巢癌 / 长链非编码RNA / RP11-499E18.1 / 上皮-间充质转化 / 恶性生物学行为

Key words

ovarian cancer / long noncoding RNA / RP11-499E18.1 / epithelial-mesenchymal transition / malignant biological behavior

卵巢癌是最常见和最致命的妇科恶性肿瘤之一，5年生存率仅为30%~50%^[1-2]。在卵巢癌早期得到诊断和治疗的患者预后通常较好，但约80%的患者在诊断时就处于晚期，因此开发可有效监测卵巢癌的肿瘤标志物至关重要^[3-5]。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA^[6]。在肿瘤的发生和发展中，lncRNA可从基因组稳定性、调控转录、表观遗传学等方面发挥多项重要的作用^[7-9]。多项研究^[10-12]表明：LncRNAs参与卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等重要过程，其异常表达与卵巢癌患者的不良预后密切相关。本研究旨在通过生物信息学方法筛选与卵巢癌预后相关的lncRNA，并通过一系列的生物实验探究其对卵巢癌细胞增殖、迁移、EMT进程等恶性生物学行为的影响，以期为开发可有效监测卵巢癌的肿瘤标志物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院/湖南省肿瘤医院医学伦理委员会批准(审批号：2021-723B)及所有患者的知情同意书。

1.2 材料

1.2.1 临床组织

从中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院/湖南省肿瘤医院获得8例卵巢癌患者的卵巢组织及相应的癌旁组织样本。参与本项研究的患者均被2名病理学专家诊断为卵巢癌，手术前均未接受任何放疗或化疗。

1.2.2 裸鼠

从中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院/湖南省肿瘤医院实验动物中心获得12只雌性BALB/c裸鼠(4~6周龄)，并在湿度45%~50%、温度25~27 ℃的无特定病原体实验室中饲养。

1.2.3 细胞系及培养基

卵巢癌细胞系CaOV3、OVCAR3、SKOV3、A2780、HO-8910和卵巢正常上皮细胞系IOSE80均购于美国细胞培养物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。CaOV3细胞在含10%胎牛血清(澳大利亚Gibco)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM；美国ATCC)中培养。SKOV3细胞在含10%胎牛血清(澳大利亚Gibco)的McCoy’s 5a培养基(美国ATCC)中培养。OVCAR3、A2780、HO-8910和IOSE80细胞在添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(美国ATCC)中培养。细胞均放置在37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养，每周更换3次培养基。CaOV3细胞和SKOV3细胞在后续实验分为3组：阴性对照(negative control，NC)组、敲减(si-RP11-499E18.1)组和过表达(pcDNA-RP11-499E18.1)组。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学方法和生存分析

从基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库中获取卵巢癌相关lncRNA数据集，并采用lncRNA测序(lncRNA-sequencing，lncRNA-seq)进行分析。使用GEO2R工具，设定P<0.05以筛选差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，采用Venn分析进一步筛选差异表达一致的lncRNAs。通过Kaplan-Meier法和log-rank检验结合生存曲线分析GEO数据库获取的相关临床数据，筛选潜在的肿瘤抑制lncRNA。

1.3.2 反转录聚合酶链反应

采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)检测lncRNA RP11-499E18.1在卵巢组织及相应的癌旁组织、卵巢正常上皮细胞系IOSE80及卵巢癌细胞系中的表达情况。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如表1所示。使用TRIzol[宝日医生物技术(北京)有限公司]提取组织和细胞中的RNA，使用RiboLock RNA酶抑制剂和DNA酶I(美国Thermo Scientific)去除基因组DNA，采用分光光度计(美国HACH)检测RNA的浓度和纯度，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)逆转录酶[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、dNTP底物[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]等完成RT-PCR。

1.3.3 蛋白质印迹法

采用蛋白质印迹法检测卵巢癌细胞中EMT相关分子E-cadherin和vimentin的表达水平。用蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液(上海Beyotime)提取细胞中的蛋白质，Nanodrop 2000系统[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]定量蛋白质，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。使用增强化学发光试剂显色，ImageJ软件进行灰度扫描并计算蛋白质的相对表达量。抗体包括抗E-cadherin(货号ab40772，美国Abcam)、抗vimentin(货号ab137321，美国Abcam)、抗β-actin(货号66009-1-Ig，美国Proteintech)及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗(货号ab6721，美国Abcam)。

1.3.4 细胞转染

人lncRNA RP11-499E18.1的全长互补cDNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；将其克隆到pcDNA3.1载体(北京Takara)中以构建过表达质粒pcDNA-RP11-499E18.1。使用DNA Midiprep试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]制备过表达质粒。通过RP11-499E18.1的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)si-RP11-310-332、si-RP11-454-476、si-RP11-589-611干扰lncRNA RP11-499E18.1的表达。将pcDNA-RP11-499E18.1和si-RP11-499E18.1通过脂质体3000(美国Invitrogen)转染到细胞中，转染CaOV3细胞和SKOV3细胞24 h后检测lncRNA RP11-499E18.1的表达水平。siRNA的序列见表2。

1.3.5 荧光原位杂交

采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术检测RP11-499E18.1在CaOV3和SKOV3细胞中的定位。分别使用U6对照探针和RP11-499E18.1探针(广州锐博生物技术有限公司)标记对应靶信号，使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色细胞核，采用共聚焦显微镜(德国Zeiss)检测荧光信号。

1.3.6 平板集落形成实验

将转染后的CaOV3和SKOV3细胞重悬，以每孔1 000个细胞的密度接种到6孔板中，在5% CO₂和37 ℃的加湿培养箱中培养2~3周。使用甲醇和0.1%结晶紫固定并染色，采用显微镜(日本Olympus)观察。

1.3.7 四甲基偶氮唑盐实验

向转染0、12、24、48、72 h的细胞中分别加入四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，使用酶标仪(美国Bio-Rad)测量570 nm处的光密度(optical density，OD)值。计算细胞增殖率：细胞增殖率=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.3.8 Transwell实验

将悬浮在无血清培养基中的细胞接种于铺有Matrigel人工基质胶的Transwell小室(美国Corning)上室，将完全培养基置于下室。下室的细胞用95%乙醇和苏木精固定染色，并通过显微镜(日本Olympus)观察。

1.3.9 荷瘤实验

BALB/c裸鼠分为实验组(注射转染pcDNA-RP11-499E18.1的CaOV3细胞)和对照组(注射转染空载体pcDNA的CaOV3细胞)。将处于对数生长期的细胞注射至饲养1周的裸鼠背部，每3 d测量1次肿瘤的宽度和长度，共测量6次。计算肿瘤体积：肿瘤体积=0.5×长度×宽度。

1.3.10 IHC

采用免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)染色检测实验组和对照组肿瘤组织中细胞凋亡相关分子Caspase 3和细胞增殖相关分子Ki67的表达水平。肿瘤组织石蜡切片脱蜡后，孵育一抗和HRP标记的二抗(货号ab6721，美国Abcam)。一抗包括抗Caspase 3(货号ab4051，美国Abcam)和抗Ki67(货号ab15580，美国Abcam)。用二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，终止反应后再用苏木精染色。采用显微镜(日本Olympus)观察。

1.4 统计学处理

每项实验均重复3次。数据采用均数±标准差表示。使用Graphpad Prism 8.0(美国CA)软件处理数据。2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LncRNA RP11-499E18.1的低表达与卵巢癌不良预后相关

本研究中分析的GEO数据集信息如表3所示。LncRNA-seq结果(图1A、1B)显示：7种lncRNA在3个数据集中表达一致上调，13种lncRNA在3个数据集中表达一致下调。与lncRNA RP11-499E18.1高表达的卵巢癌患者相比，lncRNA RP11-499E18.1低表达的卵巢癌患者的总生存期(overall survival，OS)、无进展生存期(progression free survival，PFS)均更短(均P<0.05，图1C、1D)。与正常组织相比，lncRNA RP11-499E18.1在卵巢癌组织中的表达均更低(均P<0.05，图1E~1G)。上述结果提示，lncRNA RP11-499E18.1为潜在的肿瘤抑制lncRNA。

2.2 LncRNA RP11-499E18.1在卵巢癌组织和细胞中低表达且共表达于细胞核和细胞质

RT-PCR检测结果(图2A、2B)显示：LncRNA RP11-499E18.1在卵巢癌组织的表达显著低于癌旁组织(P<0.001)；在卵巢正常上皮细胞系(IOSE80)和5种卵巢癌细胞系(CaOV3、OVCAR3、SKOV3、A2780、HO-8910)中lncRNA RP11-499E18.1均有表达，且lncRNA RP11-499E18.1在除HO-8910外的其他4种卵巢癌细胞系中的表达均显著低于卵巢正常上皮细胞系IOSE80(均P<0.001)。

FISH结果(图2C)显示：U6(对照)探针标记的信号仅在卵巢癌细胞系CaOV3和SKOV3的细胞核中可检测到；而lncRNA RP11-499E18.1探针标记的信号在这2种细胞系的细胞核和细胞质中均可检测到。表明lncRNA RP11-499E18.1在卵巢癌细胞核和细胞质中并存。

2.3 LncRNA RP11-499E18.1抑制卵巢癌细胞增殖

卵巢癌细胞系CaOV3和SKOV3的RT-PCR检测结果(图3A)显示：与NC组相比，si-RP11-499E18.1组的lncRNA RP11-499E18.1表达均明显降低(均P<0.01)，pcDNA-RP11-499E18.1组的lncRNA RP11-499E18.1表达均明显升高(均P<0.001)。平板集落形成实验结果(图3B)显示：与NC组相比，si-RP11-499E18.1组形成集落的细胞均增多，过表达后形成集落的细胞均减少。MTT实验结果(图3C、3D)显示：在CaOV3和SKOV3细胞中，si-RP11-499E18.1组的细胞增殖率均高于NC组(均P<0.05)，pcDNA-RP11-499E18.1组的细胞增殖率均显著低于NC组(均P<0.001)。

2.4 LncRNA RP11-499E18.1抑制卵巢癌细胞迁移，影响EMT相关分子的表达

卵巢癌细胞系CaOV3和SKOV3的Transwell实验结果(图4A)显示：si-RP11-499E18.1组迁移的细胞均多于NC组，pcDNA-RP11-499E18.1组迁移的细胞均少于NC组。蛋白质印迹法实验结果(图4B)显示：与NC组相比，pcDNA-RP11-499E18.1组细胞中EMT相关分子的E-cadherin的蛋白质表达水平均升高、vimentin表达均降低，而si-RP11-499E18.1组E-cadherin表达均降低、vimentin表达均升高。

2.5 LncRNA RP11-499E18.1抑制卵巢癌细胞体内增殖并促进其凋亡

实验组荷瘤小鼠的成瘤体积显著小于对照组(P<0.001，图5A、5B)。IHC实验结果(图5C)显示：实验组肿瘤组织中细胞凋亡相关分子Caspase 3表达升高(P<0.05)，细胞增殖相关分子Ki67表达降低(P<0.05)。提示lncRNA RP11-499E18.1抑制卵巢癌细胞体内增殖并促进其凋亡，与体外实验的结果一致。

3 讨 论

卵巢癌是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤，其特点包括早期症状不典型、筛查方法有限、发病率高且预后差等^{[3, 13-14]}。因此，开发可有效监测卵巢癌的生物标志物对于卵巢癌患者的诊断、治疗和预后均有重要意义。生物信息学分析作为一种新兴的生物医学研究技术，近年来在基础和临床医学研究的多个方面均得到了广泛应用^[15-16]。本研究通过生物信息学方法筛选出lncRNA RP11-499E18.1，并发现其可能作为潜在的肿瘤抑制生物标志物；进一步的实验结果表明lncRNA RP11-499E18.1可通过抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和EMT进程发挥其作用，为未来开发卵巢癌生物标志物提供了实验依据。

近年来，多种lncRNA被发现有潜力成为卵巢癌诊断以及治疗监测的靶标：lncRNA GAS5低表达预示卵巢癌患者的预后不良，并与卵巢癌临床分期为晚期显著相关^[17]；在CaOV3和OVCAR3细胞中上调表达的lncRNA XIST可抑制癌细胞的增殖、侵袭，增加对顺铂化疗的敏感性，抑制体内肿瘤生长，发挥抗癌作用^[18]；lncRNA MEG3过表达可抑制卵巢癌的进展，并通过miR-205-5p/PTEN/Akt途径增加癌细胞对顺铂化疗的敏感性^[19-20]。本研究通过分析GEO数据库相关数据集及检测临床样本，发现lncRNA RP11-499E18.1在卵巢癌组织中的表达显著下调，且其低表达与卵巢癌患者预后较差显著相关，提示lncRNA RP11-499E18.1可能成为潜在的卵巢癌生物标志物。

LncRNA在肿瘤发生和发展过程中的作用引起了广泛关注。LncRNA MAGI2-AS3过表达后可通过抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭，并促进癌细胞的凋亡，发挥抑制卵巢癌进展的作用^[21]；lncRNA EPB41L4A-AS2过表达后可抑制卵巢癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭，还可抑制裸鼠体内肿瘤的形成^[22]；下调lncRNA GAS5可促进卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT进程，而过表达lncRNA GAS5可促进卵巢癌细胞的凋亡^{[17, 23-25]}。本研究发现lncRNA RP11-499E18.1过表达后卵巢癌细胞增殖、迁移及EMT明显减弱，沉默后的结果与此相反。同时，本研究还发现在荷瘤小鼠中过表达lncRNA RP11-499E18.1可抑制体内肿瘤的生长，并促进卵巢癌细胞的凋亡。

LncRNA RP11-499E18.1是一种新发现的卵巢癌相关lncRNA，在卵巢癌的发生和发展过程中的调节机制尚未完全阐明。之前的研究表明lncRNA在细胞中的定位决定了其可能的调控方式：位于细胞质中的lncRNA主要通过调控转录后水平发挥作用^[26]；位于细胞核中的lncRNA可参与核染色质基因的表达调节^[27]。本研究发现lncRNA RP11-499E18.1以核质并存的形式存在于卵巢癌细胞中，为进一步探究lncRNA RP11-499E18.1的调节机制提供了初步证据。

在本研究中，高表达的lncRNA RP11-499E18.1通过抑制卵巢癌细胞增殖、迁移及EMT，延缓卵巢癌的进展，未来还需通过更多的实验验证lncRNA RP11-499E18.1参与卵巢癌发生和发展的具体机制，并探究其作为卵巢癌生物标志物及治疗靶点的潜在应用价值。

综上所述，本研究发现lncRNA RP11-499E18.1是一种潜在的卵巢癌生物标志物及抑制因子，可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和EMT，同时lncRNA RP11-499E18.1低表达与卵巢癌的不良预后相关。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2021JJ40322)

湖南省科技创新计划项目(2020SK51102┫。This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province ┣2021JJ40322)

the Science and Technology Innovation Plan Project of Hunan Province(2020SK51102)

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