靶向BRD4在骨肉瘤治疗中的应用及相关机制

摘要

目的：骨肉瘤转移是骨肉瘤的主要致死因素，临床缺乏有效疗法。溴结构域蛋白(bromodomain-containing protein,BRD)4是一种表观调控关键因子，其抑制剂虽在多种肿瘤中展现潜力，但在骨肉瘤中的作用机制尚未阐明。本研究旨在探究BRD4调控骨肉瘤进展的分子机制，为靶向治疗提供新策略。方法：采用免疫荧光技术在人骨肉瘤的组织芯片(含80例来自不同患者的骨肉瘤组织)中检测BRD4表达水平。下载基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)基因芯片数据集(GSE42352，含88例骨肉瘤患者生存信息)，采用Kaplan-Meier(K-M)曲线分析BRD4的表达水平对骨肉瘤患者生存期的影响。体内实验中，使用HOS细胞构建小鼠骨髓腔原位荷瘤模型，并给予不同浓度的BRD4抑制剂(+)-JQ1进行处理；采用micro-CT、骨组织3D重构及HE染色技术观察骨组织及肠道淋巴结的病理学变化。体外实验中，采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力，平板克隆技术分析细胞定点增殖能力变化，Transwell技术检测细胞侵袭能力。免疫共沉淀联合质谱技术(coimmunoprecipitation coupled with mass spectrometry,Co-IP/MS)用于分析BRD4在染色质上的分布，Co-IP联合NanoLC MS/MS技术用于分析BRD4的糖基化修饰位点及糖苷链结构。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)和蛋白质印迹法分析各指标m RNA和蛋白质的相对表达水平。结果：BRD4在骨肉瘤组织中阳性表达率达61.25%(49/80)，且高表达患者的生存期显著缩短(P<0.05)。小鼠原位荷瘤模型显示：(+)-JQ1干预可显著抑制肿瘤细胞的体内生长，并减少骨破坏(P<0.05)。(+)-JQ1可显著降低HOS细胞的增殖(P<0.001)、侵袭(P<0.001)及迁移能力(P<0.05)。骨肉瘤细胞中的BRD4以N、C两端O-GlcNAc修饰的形式存在，BRD4通过Thr73位点的O-GlcNAc修饰维持其蛋白质的稳定性，并参与调控EGFR酪氨酸激酶受体抑制剂耐受信号通路(KEGG Pathway:hsa01521)的活性。(+)-JQ1可使BRD4从增强子中的驱离，并通过下调通路中相关基因(EGFR、PDGFC)的转录水平，有效遏制骨肉瘤细胞的恶性表现。结论：BRD4以O-GlcNAc(Thr73)修饰形式参与骨肉瘤的恶性进展，在骨肉瘤生长及转移过程中具有重要作用。

关键词

骨肉瘤 / BRD4 / 糖基化修饰 / O-GlcNAc / 增强子