靶向BRD4在骨肉瘤治疗中的应用及相关机制

Application and mechanisms of targeting BRD4 in osteosarcoma

摘要

目的：骨肉瘤转移是骨肉瘤的主要致死因素，临床缺乏有效疗法。溴结构域蛋白(bromodomain-containing protein,BRD)4是一种表观调控关键因子，其抑制剂虽在多种肿瘤中展现潜力，但在骨肉瘤中的作用机制尚未阐明。本研究旨在探究BRD4调控骨肉瘤进展的分子机制，为靶向治疗提供新策略。方法：采用免疫荧光技术在人骨肉瘤的组织芯片(含80例来自不同患者的骨肉瘤组织)中检测BRD4表达水平。下载基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)基因芯片数据集(GSE42352，含88例骨肉瘤患者生存信息)，采用Kaplan-Meier(K-M)曲线分析BRD4的表达水平对骨肉瘤患者生存期的影响。体内实验中，使用HOS细胞构建小鼠骨髓腔原位荷瘤模型，并给予不同浓度的BRD4抑制剂(+)-JQ1进行处理；采用micro-CT、骨组织3D重构及HE染色技术观察骨组织及肠道淋巴结的病理学变化。体外实验中，采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力，平板克隆技术分析细胞定点增殖能力变化，Transwell技术检测细胞侵袭能力。免疫共沉淀联合质谱技术(coimmunoprecipitation coupled with mass spectrometry,Co-IP/MS)用于分析BRD4在染色质上的分布，Co-IP联合NanoLC MS/MS技术用于分析BRD4的糖基化修饰位点及糖苷链结构。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)和蛋白质印迹法分析各指标m RNA和蛋白质的相对表达水平。结果：BRD4在骨肉瘤组织中阳性表达率达61.25%(49/80)，且高表达患者的生存期显著缩短(P<0.05)。小鼠原位荷瘤模型显示：(+)-JQ1干预可显著抑制肿瘤细胞的体内生长，并减少骨破坏(P<0.05)。(+)-JQ1可显著降低HOS细胞的增殖(P<0.001)、侵袭(P<0.001)及迁移能力(P<0.05)。骨肉瘤细胞中的BRD4以N、C两端O-GlcNAc修饰的形式存在，BRD4通过Thr73位点的O-GlcNAc修饰维持其蛋白质的稳定性，并参与调控EGFR酪氨酸激酶受体抑制剂耐受信号通路(KEGG Pathway:hsa01521)的活性。(+)-JQ1可使BRD4从增强子中的驱离，并通过下调通路中相关基因(EGFR、PDGFC)的转录水平，有效遏制骨肉瘤细胞的恶性表现。结论：BRD4以O-GlcNAc(Thr73)修饰形式参与骨肉瘤的恶性进展，在骨肉瘤生长及转移过程中具有重要作用。

Abstract

Objective Metastasis is the primary cause of death in osteosarcoma, and current clinical treatments remain limited. BRD4, a key epigenetic regulator, has shown therapeutic promise in various cancers through its inhibition. However, the mechanistic role of BRD4 in osteosarcoma remains poorly understood. This study aims to elucidate the molecular mechanisms by which BRD4 regulate osteosarcoma progression and to explore novel therapeutic strategies Methods Immunofluorescence was used to assess BRD4 expression levels in a tissue microarray containing 80 osteosarcoma samples from different patients. The Gene Expression Omnibus (GEO) dataset (GSE42352, containing survival data from 88 osteosarcoma patients) was downloaded to perform Kaplan-Meier survival analysis based on BRD4 gene expression levels. In vivo, an orthotopic intramedullary osteosarcoma model was established using HOS cells in C57 mice, followed by treatment with varying doses of the BRD4 inhibitor (+)-JQ1. Micro-CT, 3D reconstruction of bone tissue, and HE staining were employed to evaluate pathological changes in bone and intestinal lymph nodes. In vitro, cell viability was measured using the methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, while colony formation and Transwell assays assessed proliferative and invasive capacities. Chromatin-bound BRD4 was analyzed via co-immunoprecipitation combined with mass spectrometry (Co-IP/MS), and O-GlcNAc glycosylation sites and glycan chains of BRD4 were identified using Co-IP with Nano-LC MS/MS. Real-time PCR and Western blotting were used to analyze the relative mRNA and protein expression levels of target genes, respectively. Results BRD4 was positively expressed in 61.25% (49/80) of osteosarcoma tissues. Patients with high BRD4 expression exhibited significantly shorter survival times (P<0.05). In the orthotopic mouse model, intervention with (+)-JQ1, a potent and commonly used BETi, significantly inhibited tumor growth in vivo and reduced bone destruction (P<0.05). (+)-JQ1 treatment significantly suppressed the proliferation (P<0.001), invasion (P<0.001), and migration (P<0.05) of HOS cells. In osteosarcoma cells, BRD4 exhibited O-GlcNAc modifications at both N- and C- C-termini, particularly at Thr73, which is essential for protein stability. This modification also contributed to the activation of the EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance pathway (KEGG Pathway: hsa01521). (+)-JQ1 treatment displaced BRD4 from enhancers and downregulated the transcription of pathway-related genes, such as EGFR and PDGFC, thereby suppressing the malignant behavior of osteosarcoma cells. Conclusion BRD4 promotes osteosarcoma progression via O-GlcNAc modification at Thr73 and plays a crucial role in tumor growth and metastasis.

Graphical abstract

关键词

骨肉瘤 / BRD4 / 糖基化修饰 / O-GlcNAc / 增强子

Key words

osteosarcoma / BRD4 / glycosylation modification / O-GlcNAc / enhancer

骨肉瘤是好发于青少年的一种原发性恶性骨肿瘤，其体细胞基因组比其他儿童恶性肿瘤具有更高的突变率且存在高度非整倍体，表现出广泛的肿瘤异质性^[1]。目前采用“术前化疗—外科手术—术后化疗”的一线综合治疗模式有效提高了患者的保肢率，5年生存率达50%~80%，但复发及转移患者的预后极差这一问题仍未解决，约30%的患者在初诊时已发生微转移，且转移灶对化疗的敏感性较原发灶显著下降，是改善患者预后的主要瓶颈^[2-3]。由于骨肉瘤二线药物治疗方案循证医学证据力度较弱，且骨肉瘤分子靶向治疗的临床研究证据有限，因此需要积极寻求新的治疗策略、优化综合治疗方案以改善患者预后。

溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extraterminal domain，BET)是重要的蛋白质结构域，通常由2个溴结构域(bromodomains，BD)和1个额外末端结构域(extra-terminal domain，ETD)组成。其中，溴结构域能够特异性识别和结合乙酰化赖氨酸残基，使BET蛋白在转录调节中发挥关键作用；而ETD结构域则辅助BET蛋白与其他蛋白质的相互作用和活性调节^[4]。BET蛋白家族的主要成员有溴结构域蛋白(bromodomain-containing protein，BRD)2/3/4和睾丸特异性蛋白(BD testis-specific protein，BRDT)，是药物开发的热门靶点，尤其在肿瘤治疗中，研究者们正致力于开发BET抑制剂(BET inhibitor，BETi)，为攻克难治性癌症提供新思路、新方法^[5]。

BRD4是BET家族中研究最为广泛的成员，在表观遗传调控中扮演着独特的“分子解码器”角色，其N端串联的BD(BD1和BD2)通过形成带正电荷的乙酰化赖氨酸结合口袋，特异性识别组蛋白H3K27ac等表观遗传标志，而C端结构域则通过招募正转录延伸因子b(positive transcription elongation factor b，P-TEFb)等复合物，动态调控RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化状态，从而参与关键基因的转录起始与延伸过程^[6]。肿瘤细胞相较于正常细胞表现出显著的“表观遗传脆弱性”，由于其染色质处于高度动态的开放状态，且存在组蛋白乙酰化水平的全局失调，使得靶向BRD4的表观遗传干预具备选择性杀伤肿瘤细胞的潜在优势^[7]。在癌症中，BET蛋白，特别是BRD4的异常表达，可促进肿瘤细胞侵袭和转移的进展，因此成为肿瘤中最具潜力的干预靶点^[6]。研究者^[8-10]曾报道抑制BRD4对骨肉瘤有效。但目前研究仍存在关键盲区，BRD4表达与骨肉瘤患者群体特征的相关性、在骨肉瘤基因组表观遗传重塑中的确切作用以及其活性形式的结构基础等核心科学问题亟待深入解析。

肿瘤转移是导致大部分(约85%)骨肉瘤患者死亡的原因，由肿瘤细胞发生一系列复杂变化所引起，而这些变化特征与肿瘤发生时的特征有所不同^[11]。有学者^[10]曾基于“增强子活性是细胞表型和细胞类型特异性基因表达的基石”这一理论基础，研究并发现了转移相关增强子位点及其所调节的基因是骨肉瘤转移发生过程中的关键因素。而巧合的是，在许多癌基因的超级增强子(super enhancers，SEs)中，BRD4是首选辅助因子，它能够同时结合组蛋白和转录因子，维持癌基因的高转录活性，这一机制在多种恶性肿瘤中广泛存在^[12-13]。本课题组前期研究^[14]发现，BRD4通过整合脂质代谢相关基因的增强子调控复合物，直接参与肿瘤细胞中的脂质代谢重编程。基于上述证据，本研究聚焦核心科学问题：靶向抑制BRD4能否有效干预骨肉瘤进展？若存在疗效，其作用机制是否与调控增强子活性相关？

本研究旨在探索靶向BRD4在骨肉瘤综合治疗中的应用潜力，并从表观遗传调控的角度揭示BRD4可能涉及的分子机制，以期为克服骨肉瘤转移这一世界性难题提供依据。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅二医院实验动物伦理委员会批准(审批号：20241023)。

1.2 Kaplan-Meier分析

下载基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)基因芯片数据集(GSE42352)，该数据集包含有88例骨肉瘤患者的生存信息，采用Kaplan-Meier(K-M)曲线分析BRD4的表达水平对骨肉瘤患者生存期的影响。采用统计最优分割法，先得出所有的基因表达阈值，然后经log-rank检验选择P值最小的分割点，即使2组生存差异最大化的分割点。随后，仅保留满足高、低表达组均有≥8例有效数据分割点，确定为最终的BRD4表达水平分组阈值。

1.3 细胞培养

HOS细胞株(人骨肉瘤细胞)购自湖南丰晖生物科技有限公司，在添加了10%的胎牛血清(美国Invitrogen公司)的DMEM高糖培养基(美国Thermo Fisher公司)中培养。培养温度为37 ℃，CO₂浓度为5%，湿度为90%~95%。

1.4 动物实验

通过向小鼠股骨内注射肿瘤细胞的方式构建骨肿瘤原位荷瘤模型。相较于皮下荷瘤，该模型能更好地模拟人类肿瘤在骨骼微环境中的生长及转归，也是适宜的骨肉瘤转移研究模型。4周龄的雄性BALB/C裸鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。实验开始前，先适应性饲养7 d。在进行肿瘤细胞接种前，先使用0.5%的戊巴比妥钠以40 mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔麻醉。在手术显微镜下，切开皮肤和皮下组织，以暴露远端股骨干骺。首先，使用电动骨钻在骨髓腔内垂直于股骨长轴方向钻孔；接着，使用微量进样器向骨髓腔内注入20 μL的HOS细胞悬液(约5×10⁵个细胞)；随后迅速用骨蜡封闭腔体，并用乙醇擦拭以清除遗留在髓腔外的肿瘤细胞。将皮肤切口缝合后，进行8周的精心喂养。

BRD4抑制剂(+)-JQ1购自美国Selleck公司。将成瘤的小鼠随机分为对照组、(+)-JQ1低浓度组(2 mg/mL)和(+)-JQ1高浓度组(4 mg/mL)，分别向小鼠的腹腔注射50 μL的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)或等体积的(+)-JQ1。每周注射2次，连续注射4周。实验结束后，通过微型计算机断层扫描(micro-CT)评估小鼠的股骨病理损伤及肿瘤细胞腹腔转移情况。称量并记录各组小鼠体重，随后解剖，将小鼠的股骨组织及肠道内壁转移癌组织取下，固定于中性甲醛中，以待后续病理制片及染色分析。

1.5 组织病理学染色

采用HE染色对股骨组织及肠道结节组织进行染色。将取材并固定好的小鼠股骨组织进行脱钙，待其软化后，与肠道内壁的转移癌组织一起进行石蜡包埋及病理制片。在HE染色之前，先将玻片在60 ℃下加热20 min以完成脱蜡。HE染色主要包括水化、苏木精-伊红染色、分化、透明以及封片5个步骤，具体操作参照既往研究^[14]。采用病理切片扫描仪(3D-HISTECH)进行组织玻片的全片扫描，并做病理学分析。

1.6 BRD4表达检测

采用免疫荧光法检测人骨肉瘤组织芯片(购自湖南艾方生物科技有限公司)中的BRD4表达水平。首先将组织芯片放入二甲苯中脱蜡，然后通过梯度乙醇逐步水合，PBS洗涤干净后，将组织芯片置于盛满乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修复液的修复盒中在微波炉内进行抗原修复。使用牛血清白蛋白封闭1 h，随后在组织芯片上滴加抗BRD4的一抗抗体(英国Abcam公司；1꞉200)，于4 ℃孵育过夜。将残留抗体用PBS洗涤干净后，加入GFP荧光标记的二抗(美国Immunoway公司，1꞉1 000)，于25 ℃再次孵育1 h。PBS洗涤去除残留抗体后，添加4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)继续孵育5~10 min以标记细胞核。最后，使用抗荧光淬灭封片剂进行封片，于病理切片扫描仪中进行组织芯片的全景扫描。

1.7 细胞活力检测

采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试验检测(+)-JQ1对HOS细胞活力的影响。于96孔板中每孔接种5×10³个左右的HOS细胞，贴壁后，向培养孔中加入不同浓度的(+)-JQ1(0~10 μmol/L；美国Selleck公司)孵育24 h。按照厂家提供的MTT检测试剂盒(德国Merck公司)说明书进行MTT试验，最后通过微孔板酶标仪于490 nm处测量各孔的吸光度值。

1.8 细胞克隆形成能力检测

采用平克隆检测法检测各组HOS细胞的增殖能力。首先，采用不同浓度的(+)-JQ1(5、10 μmol/L)预处理HOS细胞24 h，然后以500个细胞/孔的密度在6孔板中接种细胞，贴壁过夜。用增殖诱导剂处理细胞，观察2~3周后，将6孔板中的细胞固定，并用结晶紫(北京索莱宝科技有限公司)染色。于倒置显微镜下计算克隆数量，其中超过50个细胞的集群被认为是阳性克隆点。

1.9 细胞侵袭能力检测

采用Transwell嵌套培养皿检测各组HOS细胞的侵袭能力。首先，将HOS细胞在完全培养基中培养至对数生长期。收集细胞并重悬于无血清培养基中，调整细胞浓度至1×10⁵个/mL。将200 μL细胞悬液加入Transwell上室，在下室中添加含有10%胎牛血清的完全培养基。随后，分别向培养基中添加(+)-JQ1(5、10 μmol/L)处理24 h，再将小室置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养24 h。取下Transwell上室并用PBS轻轻洗涤，4%多聚甲醛固定细胞10 min后，再用结晶紫染色20 min。随机选取3个视野，在显微镜下对穿过上室基质胶的细胞数量进行计数并拍照，用于细胞侵袭能力的评估。

1.10 免疫共沉淀

采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)技术分析BRD4蛋白的氧连接的N-乙酰葡糖胺(O-linked β-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)修饰水平及泛素修饰水平。首先，向HOS细胞的蛋白裂解液中添加BRD4的IP级抗体(英国Abcam公司；1꞉100)，于4 ℃孵育过夜。然后，将Protein A/G磁珠(美国MCE公司)加入混合物中继续孵育，以促进免疫复合物的形成。最后，将免疫复合物从磁珠中洗脱，并在所获得的沉淀产物中通过蛋白质印迹法检测O-GlcNAc转移酶(英国Abcam公司；1꞉500)和泛素小分子(英国Abcam公司；1꞉500)的含量。

1.11 染色质免疫共沉淀

采用染色质免疫共沉淀技术(chromat-inmmunoprecipitation，ChIP)技术分析BRD4在骨肉瘤细胞中的染色质分布情况。首先，裂解骨肉瘤细胞样品并进行超声破碎，生成200~500 bp的DNA片段。然后，使用BRD4(英国Abcam公司；1꞉100)的ChIP级抗体沉淀“蛋白/DNA”复合物，具体操作步骤按试剂盒厂家说明书(美国CST公司)进行。最后，将获得的染色质片段产物送北京诺禾致源科技股份有限公司进行测序服务。将测序原始结果导入UCSC Genome Browser Home数据库中的“My Data- Custom Tracks”，对BRD4的染色质分布情况进行可视化，并通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集法分析BRD4最有可能影响的信号通路。

1.12 Co-IP联合Nano-LC MS/MS技术分析BRD4糖化位点及糖链结构

使用Co-IP联合纳米液相电泳耦合质谱技术(Nano-LC MS/MS)分析BRD4糖化位点及糖链结构。首先，在骨肉瘤细胞的蛋白裂解液中使用BRD4的IP级抗体(英国Abcam公司；1꞉100)进行免疫沉淀以富集BRD4蛋白，其IP产物经SDS-PAGE分离后，将130~180 kD处(即BRD4蛋白所在位置)的蛋白质条带分别用胰蛋白酶、糜蛋白酶以及胰蛋白酶+Glu-C蛋白酶进行消化以提取肽段。随后，在Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪(美国Thermo Fisher公司)上设定为阳性产物鉴定峰值，使用Byonic蛋白质质谱检索软件在人类蛋白质数据库中检索原始质谱光谱。最后，使用O-GlcNAc Database(V1.2)数据库检索糖基链类型。

1.13 实时反转录聚合酶链反应

采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)分析细胞中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)及血小板衍生生长因子C(platelet-derived growth factor-C，PDGFC)的mRNA水平。首先，使用TRIzol试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)从骨肉瘤细胞中分离总RNA。随后，每500 ng RNA样品用反转录试剂盒(美国Promega公司)进行cDNA合成。最后，采用SYBR-Green法进行real-time RT-PCR检测，以GAPDH为内参，2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对mRNA水平。

扩增引物如下：EGFR正向为5'-GTGAAAACA-CCGCAGCATGT-3'，反向为5'-TTCCAGACAAGCC-ACTCACC-3'；PDGFC正向为5'-CGAGCCCGAAC-AAGGTGAAC-3'，反向为5'-GCGACTCCCGAGTCT-CTTTC-3'；GAPDH正向为5'-AATGGGCAGCCGTT-AGGAAA-3'，反向为5'-GCGCCCAATACGACCAA-ATC-3'。

1.14 统计学处理

使用SPSS及Graph Pad统计软件对数据进行统计与分析。计数资料以例(%)表示，采用χ²检验分析 BRD4的表达水平高低与患者年龄、性别、TNM分期及肿瘤分级的相关性；计量资料以均数±标准差表示，2组间比较采用Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)的事后Tukey检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 BRD4在骨肉瘤组织中普遍表达，且高表达BRD4的患者生存期较短

BRD4在骨肉瘤组织中的阳性样本检出率为61.25%(49/80)。其中，BRD4高表达检出率为33.75%(27/80)，中表达检出率为27.50%(22/80)，其余表达低或极弱，代表性染色见图1A。BRD4在3例骨肉瘤伴远端转移患者肿瘤组织(T3N0M1、T2N0M1、T3N0M1)中的检测结果显示：BRD4的表达定位于细胞核，阳性率接近100%(图1B)。K-M生存分析中，BRD4的表达水平分组阈值为253.7，log₂(253.7)=7.987(图1C)，即log₂值低于7.987划分为BRD4相对低表达患者组(n=66)，高于7.987划分为BRD4相对高表达患者组(n=22)。K-M生存分析结果显示：高表达BRD4的骨肉瘤患者的生存期较低表达患者显著缩短(P=0.039，图1D)。

相关性分析结果显示：BRD4的表达水平与骨肉瘤患者的年龄、性别、肿瘤分级及TNM分期等变量均无显著相关性(均P>0.05，表1)。

2.2 (+)-JQ1可抑制骨肉瘤细胞的体内生长

Micro-CT结果显示：在骨髓腔接种HOS细胞8周后，小鼠股骨表面纹路粗糙，肿瘤接种附近处骨髓腔隆起明显(图2A)。HE染色结果显示：肿瘤种植附近被成骨细胞构成的新生骨基质所包围，骨形态结构受到严重破坏(图2B)。这说明肿瘤细胞生长对股骨结构造成了严重破坏，肿瘤性成骨的同时也伴随严重的骨侵蚀。Micro-CT及解剖查体发现小鼠肠道内壁有多个结节性凸起，主要在小肠、回肠、盲肠等肠段随机分布，直肠少见(图2H)。经HE染色鉴定，这些结节为肠道派尔集合淋巴结，也称肠道派氏结(Peyer’s patches，PPs)，提示体内肿瘤细胞生长有关的淋巴结肿大(图2J)。

不同浓度(+)-JQ1腹腔注射均可降低在股骨组织及PPs中的BRD4表达水平(图2G、2K)。(+)-JQ1能够显著缓解癌细胞生长对小鼠股骨骨质所造成的破坏，且高浓度的处理效果更佳(图2A、2B)。股骨骨质量百分比(bone volume per tissue volume，BV/TV)、骨小梁密度(trabecular number，Tb.N)以及厚度(trabecular thickness，Tb.Th)较对照组显著回升，而骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)下降(均 P<0.05，图2C~2F)。此外，(+)-JQ1也显著减少了小鼠体内PPs的数量。相较于无处理组的(11±3)个，(+)-JQ1低浓度组小鼠体内的PPs数量下降至(7±2)个，(+)-JQ1高浓度组进一步降至(4±2)个，差异均有统计学意义(均P<0.05，图2H~2I)。

2.3 (+)-JQ1抑制骨肉瘤细胞活性及侵袭转移能力

MTT的检测结果显示：随着(+)-JQ1处理浓度的升高(0~10 μmol/L)，HOS细胞活性呈剂量依赖性下降(均P<0.001，图3A)。平板克隆实验结果显示细胞定点增殖能力受到显著抑制(均P<0.001，图3B)。划痕试验及Transwell小室实验的结果则表明骨肉瘤细胞的转移及侵袭能力也在(+)-JQ1处理后受到显著抑制(均P<0.001，图3C、3D)。

2.4 骨肉瘤细胞中BRD4以O-GlcNAc 糖基化修饰的形式存在

通过Co-IP联合LC-MS/MS技术，鉴定出3个全新的BRD4修饰位点，分别为：苏氨酸73(Thr73)位点的HexNAc(5)Hex(3)糖型修饰、丝氨酸1351(Ser1351)位点的HexNAc(1)Hex(1)糖型修饰及丝氨酸1355(Ser1355)位点的HexNAc(3)Hex(3)糖型修饰(图4A)。其中，Thr73修饰位点位于BRD4的第1个BD(BD1)中，2个连续的Ser修饰位点(Ser1351/Ser1355)则位于羧基末端结构域(C-terminal domain，CTD)中。通过数据库比对发现，这些位点位于BRD4蛋白的N、C两端，且不与已知的BRD4磷酸化修饰竞争相同的Thr或Ser修饰位点(图4B)。这说明骨肉瘤细胞中可能存在一套独立的BRD4 O-GlcNAc糖基化修饰模式，可确保其活性不受影响。

进一步分析发现，位于N端Thr73位点的修饰与BRD4连续的泛素化修饰位点(K91、K99、K111)在空间位置上十分靠近，因此，不排除该位点上HexNAc(5)Hex(3)糖苷链加入可能会干扰泛素连接酶对BRD4底物的识别(图4C、4D)。使用O-GlcNAc转移酶抑制剂Ac5SGlcNAc成功降低了HOS细胞中BRD4的O-GlcNAc修饰水平，但其泛素化修饰水平显著提升(图4E)。相较于BRD4野生型融合蛋白(WT-HA)，BRD4(Thr73)突变型融合蛋白(T73A-HA)的泛素化修饰水平显著增高，但糖基化水平下降(图4F)。这说明N端Thr73位点上的糖苷链加入有助于维持BRD4蛋白的稳定，从而延长其在骨肉瘤细胞内的半衰期。

2.5 (+)-JQ1将BRD4从增强子位置驱离

不论是否使用(+)-JQ1，BRD4在基因结构上的分布比例基本相似。BRD4主要分布于基因内部[DMSO组49.4%；(+)-JQ1组44.1%]，其余依次分布于内含子区[DMSO组30.4%；(+)JQ1组30.1%]、转录起始位点上游的2 000 bp之内[DMSO组12.8%；(+)JQ1组9.5%]、外显子区[DMSO组8.7%；(+)JQ1组7%]，以及基因下游2 000 bp内[DMSO组4%；(+)JQ1组4%](图5A)。KEGG通路分析结果提示，受(+)-JQ1影响的BRD4靶基因显著富集于EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐受途径(KEGG map01521)，该途径中包含2个常见的参与肿瘤细胞增殖及血管生成的基因：EGFR和PDGFC(图5B)。图6A和图6B对比展示了有、无(+)-JQ1时EGFR和PDGFC基因所在的第7和第4号染色体上BRD4的分布位置，同时以VISTA人类增强子数据库所收录的对应染色体上的增强子位置信息作为参照。在溶剂对照组中，BRD4的基因组分布比增强子更密集，且能够覆盖大部分增强子所在位置。但在(+)-JQ1处理后，BRD4的分布位置虽然没有发生改变，但分布密度显著下降。BRD4在EGFR和PDGFC基因组上的结合位置与H3K27ac和H3K4me1这2个活性增强子标志物的所在位置相同，这说明BRD4可能参与了活性增强子的调节。而在(+)-JQ1处理后，BRD4在上述位置的分布密度显著下调。由此可见，(+)-JQ1能够将BRD4从增强子中驱离。进一步的real-time PCR检测结果也显示，EGFR和PDGFC的转录水平在(+)-JQ1处理后显著下降(均P<0.01，图6C)，再次证明靶向BRD4对骨肉瘤的抑制机制与增强子的活性有关。

3 讨 论

骨肉瘤是一种原发性恶性骨肿瘤，10%~15%的患者在初诊时已出现转移，这些患者的5年生存率仅为20%，预后极差。目前的治疗瓶颈在于将骨肉瘤视为一种单一疾病，并采用相似的治疗方案。然而，骨肉瘤的遗传复杂性提示必须从其遗传学和生物学的角度进行更深入的研究与理解，才能实现真正的治疗突破^[9]。

本研究采用免疫荧光法检测人骨肉瘤的组织芯片中BRD4的表达，结果发现BRD4在骨肉瘤组织中具有较高的表达水平，且高表达提示患者的短期生存。本研究暂未发现BRD4的表达水平与骨肉瘤患者的发病年龄、性别及肿瘤分期分级等因素显著相关，可能为骨肉瘤临床组织标本采集的局限性所致。根据该芯片中的癌组织信息，有58例样本(58/80，72.50%)在采集时患者已经接受过化疗、免疫治疗或综合治疗方案，因此不排除这些治疗手段可能会对BRD4的表达水平产生不可预测的影响。但无论如何，BRD4高表达与患者短期存活率的显著相关性提示靶向BRD4在骨肉瘤治疗中的应用潜力。

骨肉瘤的发病率低，难以开展大规模的临床试验。因此，利用人源细胞异种肿瘤模型在临床前筛选合适的药物治疗靶点是目前唯一的选择。本研究构建了人骨肉瘤细胞原位种植瘤小鼠模型，通过腹腔注射不同剂量的(+)-JQ1来探讨靶向BRD4对骨肉瘤的作用。结果表明(+)-JQ1在抑制骨肉瘤方面的效果十分显著，并且剂量越高，效果越好。不仅如此，在接种癌细胞的股骨组织附近，骨质结构的破坏及骨量丢失等问题也得到了显著缓解，因癌细胞生长及扩散刺激形成的PPs的数量也显著下降。体外实验表明：不论是骨肉瘤细胞的增殖活性还是侵袭转移能力，(+)-JQ1的处理均有显著抑制作用。上述结果有效证明了BRD4是骨肉瘤中行之有效的干预靶点。

大部分转录因子的转录活性及稳定性受到O-GlcNAc修饰的影响^[15]，O-GlcNAc修饰通过影响转录因子或重塑染色质来驱动癌症中的基因转录^[16]。研究^[17-20]表明，许多真核生物蛋白的Ser和Thr侧链羟基上存在O-GlcNAc修饰，但与细胞膜表面蛋白的N-GlcNAc修饰不同，O-GlcNAc发生在常驻细胞核和细胞质的蛋白质上，因此会在基因的转录调控、蛋白质稳定性、细胞内信号转导及代谢调节等方面发挥关键作用。BRD4是一种胞核蛋白，因此应考虑O-GlcNAc修饰对其功能的影响。本研究结果显示骨肉瘤细胞中的BRD4存在N、C两端O-GlcNAc修饰，其中，N端Thr73位点的HexNAc(5)Hex(3)糖型修饰显著提升了HOS细胞中BRD4蛋白的稳定性，而C端2个连续位点(Ser1351/Ser1355)的O-GlcNAc修饰很好地证明了O-GlcNAc糖基转移酶对其修饰底物的识别及催化活性具有CTD结构域依赖性特征^[18]。截至目前，已被报道的BRD4 O-GlcNAc修饰位点集中在非N端的中间区域以及C末端区域(详见OVSlab_O-GIcNAcome-人类糖基化蛋白表)，而本研究的结果则为进一步了解N端糖基化修饰对BRD4蛋白稳定性的意义提供了新的研究证据。

骨肉瘤细胞中的增强子研究较少，本研究首次通过比对BRD4的染色质分布情况来探查(+)-JQ1对骨肉瘤的抑制作用是否与相关增强子活性的变化有关。本研究结果直观展现了(+)-JQ1对BRD4的染色质驱离作用，尤其对EGFR酪氨酸激酶受体抑制剂耐受信号途径中的基因影响最为显著。以EGFR和PDGFC基因为例，作为活性增强子标志的H3K27ac和H3K3me1所在位置与BRD4结合位置基本重叠，提示骨肉瘤细胞中的BRD4可能参与EGFR和PDGFC基因的转录激活。EGFR虽然不是骨肉瘤细胞生长的主要驱动因素，但有助于饥饿和化疗诱导的应激生存^[21]。同时，EGFR也是被体内外研究所证实的可参与骨肉瘤转移级联反应途径的靶蛋白^[22-23]。而骨肉瘤中的PDGFC信号活化则可将其受体阳性的细胞募集到肿瘤微血管周围，导致血管成熟的同时也促进了骨肉瘤的生长与转移^[24]。本研究结果显示(+)-JQ1的处理能显著下调EGFR和PDGFC基因的转录水平，同时造成BRD4在二者活性增强子区的分布减少。这说明靶向BRD4对骨肉瘤增殖及转移能力的抑制与BRD4所控制的增强子活性的丧失有关。因此，抑制EGFR和PDGFC对增强骨肉瘤的治疗效果或遏制肿瘤的进展有利，靶向BRD4可能是一举多得的策略。

本研究尚存在局限性。其一，使用BETi对BRD4的生物学功能进行限制从而确定了靶向BRD4的抗肿瘤作用，但对其O-GlcNAc修饰形式的功能研究未做深入探讨。鉴于O-GlcNAc修饰是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，其动态变化对骨肉瘤的影响值得进一步研究。其二，仅分析受BETi影响的BRD4潜在靶基因(如EGFR、PDGFC)，未与BRD4一起进行功能回复验证，以最终确认BRD4会通过上调二者的表达水平来促进骨肉瘤细胞的恶性进展。

综上，本研究发现BRD4以O-GlcNAc(Thr73)修饰形式参与骨肉瘤的恶性进展，在骨肉瘤生长及转移过程中起重要作用。靶向BRD4的相关策略在骨肉瘤治疗中的应用值得进一步探索。

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国家自然科学基金(82273263┫。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ┣82273263)

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