WNT10A在甲状腺乳头状癌中的表达及对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响

Expression of WNT10A in papillary thyroid carcinoma and its effect on cell proliferation, invasion, and metastasis

摘要

目的：甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinomas,PTC)淋巴结转移与患者复发和生存率密切相关，现有技术难以检测隐匿性颈部淋巴结转移，寻找准确预测PTC淋巴结转移的分子标志物和方法具有重要临床意义。本研究旨在分析WNT10A在PTC中的表达及临床意义，并探讨WNT10A基因敲减在PTC癌细胞增殖、侵袭和转移中的作用。方法：利用基于基因表达水平的交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)和阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析门户(University of Alabama at Birminghara Cancer data analysis Portal,UALCAN)数据库在线分析WNT10A在甲状腺癌中的表达。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)法检测32例PTC患者的癌组织和癌旁组织中WNT10A mRNA的表达。采用免疫组织化学染色方法检测158例PTC标本的癌组织及癌旁组织中WNT10A蛋白的表达，并分析其与临床病理参数的关系。选取K1和TPC-1细胞进行细胞实验，采用Celigo和四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法观察干扰后肿瘤细胞增殖情况的变化，流式细胞仪检测细胞凋亡，细胞划痕和Transwell侵袭实验检测干扰后肿瘤细胞体外转移、侵袭能力。建立PTC异种移植瘤模型，观察并记录裸鼠的生长状态，根据瘤体重、体积比较2种细胞株成瘤结果差异。采用mRNA-seq法筛选WNT10A调控的差异基因，并对差异基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和基于独创性路径分析(ingenuity pathway analysis,IPA)的经典通路分析。采用real-time RT-PCR及蛋白质印迹法验证WNT10A对Tec激酶信号通路下游关键分子mRNA和蛋白质表达的影响。结果：GEPIA和UALCAN数据库分析显示WNT10A mRNA在甲状腺癌组织中的表达均明显高于癌旁组织(均P<0.01)。Real-time RT-PCR结果显示WNT10A mRNA在PTC癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01)。免疫组织化学染色结果显示WNT10A在PTC癌组织中高表达，与相应的癌旁组织相比差异有统计学意义(P<0.01)，并且与PTC的多灶性、腺外侵袭及淋巴结转移相关。WNT10A基因敲减能够显著抑制K1和TPC-1细胞的增殖，改变细胞周期分布，增加凋亡细胞占比(均P<0.01)。细胞划痕及Transwell侵袭实验发现敲减WNT10A基因能够降低K1和TPC-1细胞的侵袭、转移能力。裸鼠荷瘤实验证明敲减WNT10A基因在TPC-1细胞株中起抑制肿瘤的作用。GO分析和IPA显示Tec激酶信号通路是WNT10A作用的关键信号通路；real-time RT-PCR和蛋白质印迹法验证结果显示在K1细胞系中敲减WNT10A后，Tec激酶信号通路下游关键基因STAT3、MAPK8、TNFRSF21和AKT2的mRNA和蛋白质水平均出现不同程度的下调。结论：WNT10A基因在PTC癌组织中高表达，且与PTC的侵袭、转移有关，其高表达具有促进PTC细胞增殖及侵袭的作用，其机制可能与抑制Tec激酶信号通路表达有关。

Abstract

Objective Lymph node metastasis in papillary thyroid cancer (PTC) is closely associated with tumor recurrence and patient survival. However, current technologies have limited sensitivity in detecting occult cervical lymph node metastases. Identifying accurate molecular markers for predicting PTC metastasis holds significant clinical value. This study aims to analyze WNT10A expression in PTC and its clinical significance, and to explore the role of WNT10A gene knockdown in PTC cell proliferation, invasion, and metastasis. Methods The expression of WNT10A in thyroid carcinoma was analyzed using the Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) and University of Alabama at Birminghara Cancer data analysis Portal (UALCAN) databases. Real-time RT-PCR was used to measure WNT10A mRNA levels in tumor and adjacent normal tissues from 32 PTC patients. Immunohistochemistry was conducted on 158 PTC specimens to assess WNT10A protein expression and its correlation with clinicopathological features. In vitro experiments were performed using K1 and TPC-1 cell lines. Cell proliferation was assessed using the Celigo system and methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assays; apoptosis was measured via flow cytometry; invasion and metastasis were evaluated using scratch and Transwell assays. A xenograft model was established in nude mice to observe tumor growth, and tumor weight and volume were compared between cell lines. Differentially expressed genes regulated by WNT10A were identified via mRNA sequencing, followed by Gene Ontology (GO) and ingenuity pathway analysis (IPA). Real-time PCR and Western blotting were used to validate the effects of WNT10A on key downstream mRNA and protein in the Tec kinase signaling pathway. Results WNT10A mRNA expression was significantly higher in thyroid cancer tissues compared to adjacent normal tissues according to GEPIA and UALCAN (both P<0.01). The real-time RT-PCR result showed that WNT10A mRNA expression in PTC tissues was high than that in adjacent tissues (P<0.01). Immunohistochemistry revealed significantly higher WNT10A protein expression in PTC tissues compared to adjacent tissues (P<0.01), and its expression correlated with multifocality, extrathyroidal invasion, and lymph node metastasis. WNT10A knockdown significantly inhibited proliferation, altered cell cycle distribution, and increased apoptosis in K1 and TPC-1 cells (all P<0.01). WNT10A silencing also reduced migration and invasion abilities in both cell lines. In vivo, WNT10A knockdown in TPC-1 cells suppressed tumor formation in nude mice. GO analysis and IPA suggested that the Tec kinase signaling pathway was a key downstream target of WNT10A. RT-PCR and Western blotting confirmed that WNT10A knockdown downregulated the expression of key genes (STAT3, MAPK8, TNFRSF21, and AKT2) in this pathway. Conclusion WNT10A is highly expressed in PTC and is associated with tumor proliferation, invasion, and metastasis. Its tumor-promoting effects may be mediated through suppression of the Tec kinase signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

甲状腺乳头状癌 / WNT10A / 增殖 / 侵袭 / 转移 / Tec激酶信号通路

Key words

papillary thyroid carcinoma / WNT10A / proliferation / invasion / metastasis / Tec kinase signaling pathway

甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，同时也是最常见的内分泌癌。近年来，甲状腺癌发病率逐年增长^[1]。其主要病理类型有甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)、滤泡癌、未分化癌和髓样癌等，其中PTC比例超过80%^[2]。一般而言，PTC发展缓慢，病程较长，预后较好，但也有很多PTC患者因无临床症状，一经发现，即伴有淋巴结转移、被膜侵犯等情况，导致预后不佳，故仍需早发现、早诊断、早治疗。PTC的发病机制与BRAF基因突变^[3-4]、RET/PTC基因重排等有关^[5-6]，但目前有关PTC的发病机制仍未完全明确。因此，研究PTC的浸润和转移过程，寻找早期诊断甲状腺癌、预测转移的生物标志和干预治疗的靶分子，对进一步提高患者治愈率与生存率具有重要意义。

WNT10A作为Wnt家族中的重要成员，在胃癌、结直肠癌、肾细胞癌、卵巢癌和子宫内膜癌等多种恶性肿瘤中均高表达^[7-12]，此外，WNT10A对肿瘤的生长和转移起重要作用。Li等^[13]发现WNT10A在结肠癌组织中表达上调，且其表达水平与肿瘤分期有关，敲减其表达能抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。但是WNT10A基因在PTC的发生、侵袭、转移过程中是否发挥作用，分子机制如何均不清楚。本研究旨在探讨WNT10A在PTC中的表达及临床意义，并探讨WNT10A基因敲减在PTC细胞增殖、侵袭和转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅三医院伦理委员会批准(审批号：2021-S222)。

1.2 生物信息学分析及预测

利用阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析门户(University of Alabama at Birminghara Cancer data analysis Portal，UALCAN)数据库分析WNT10A基因在甲状腺癌组织和癌旁正常组织中的表达水平。根据甲状腺癌组织中WNT10A基因表达水平值的中位数，将所有甲状腺癌患者分为高、低表达组，通过基于基因表达水平的交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)数据库分析WNT10A基因高、低表达水平对甲状腺癌症患者总体生存率的影响。

1.3 标本收集及real-time RT-PCR

收集2022年6月至2023年4月在中南大学湘雅三医院就诊的经病理确诊的32例PTC患者的癌组织和癌旁组织。使用TRIzol试剂从32对PTC组织和癌旁组织中分离总RNA。组织被切除、裂解并研磨，离心后收集上清液。GAPDH的上游引物为5'-TGAC-TTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物为5'-CACC-CTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；WNT10A的上游引物为5'-ATCGCCTTGGCTCTTGGG-3'，下游引物为5'- GGAGACAGACTGACGGGTTGC-3'。将反转录引物和总RNA转移到PCR管中并离心。通过反转录合成cDNA，反应条件为：73.5 ℃ 7 min，43.5 ℃ 60 min，73.5 ℃ 10 min。运用两步法对产物进行real-time RT-PCR分析。

1.4 病例资料

收集2022年1月至2023年5月在中南大学湘雅三医院甲状腺外科手术后经病理诊断为PTC的患者158例，其中男56例，女102例，年龄23~65(41±19)岁。所有患者术前均未行放疗或化疗等治疗，收集PTC的临床分期及淋巴结转移情况。

1.5 免疫组织化学染色

将158例4 μm厚的石蜡包埋组织切片用二甲苯脱蜡，在浓度梯度递减的乙醇中水化，采用微波加热提取抗原。以3%过氧化氢室温孵育30 min，灭活内源性过氧化物酶；用山羊血清封闭30 min，滴加一抗(1꞉100稀释的兔抗人WNT10A)，4 ℃孵育过夜；室温复温30 min后，滴加生物素标记的兔抗人免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G，37 ℃孵育30 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。DAB显色，复染，脱水，透明，封片。

在400倍光镜下，每张切片选取5个高倍视野, 细胞质或细胞膜染色为棕褐色或黄色的颗粒判断为阳性细胞。染色强度评分：强表达记3分，中度表达记2分，弱表达记1分，阴性记0分。染色阳性率评分：阳性细胞比例为76%~100%记4分，51%~75%记3分，26%~50%记2分，1%~25%记1分，<1%记0分。以染色强度评分和染色阳性率评分的乘积为总分进行分组，≤6分为低表达组，>6分为高表达组。

1.6 细胞培养、感染和敲减

1.6.1 细胞培养和感染

将人PTC细胞系K1和TPC-1细胞(购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司)在37 ℃、5% CO₂的DMEM高糖培养基中培养。当细胞汇合度达80%左右再进行传代培养，传代3次后进行检测。使用慢病毒载体沉默WNT10A表达，将WNT10A的shRNA(5'- GAGATTGGACCACATGAT-3')插入慢病毒的pGCSIL-GFP中，称为shWNT10A；无意义序列(5'- TCTCCCGAACGTGTCACGT-3')插入阴性对照慢病毒，称为shCtrl。分别用shWNT10A和shCtrl感染K1和TPC-1细胞。转染4~6 h后，更换新鲜培养基并继续培养。48 h后终止培养，收集对数期和3代内培养良好的PTC细胞用于后续实验。

1.6.2 RT-PCR对稳定转染细胞株的敲减效率进行验证

收集上述PTC细胞，以2 000 r/min离心5 min，在弃除上清液的细胞沉淀物中加入总RNA抽提试剂，充分混匀后转移至新的EP管中，随后按照说明书提取细胞RNA，利用反转录试剂盒将RNA进行反转录获得cDNA，按照TAKARA SYBR Master Mixture试剂盒说明书进行RT-PCR检测目的基因表达。以GAPDH作为内参，所用引物序列同1.3。

1.7 Celigo细胞计数检测细胞生长

将处于对数生长期的shCtrl和shWNT10A组细胞用胰蛋白酶消化后，再用完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；在96孔板中铺板，每孔2 000个细胞，每组设3个复孔，培养体系为100 μL/孔，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养；铺板后第2天开始，每天检测读板1次，连续检测读板3~5 d；计算带绿色荧光的细胞数量，绘制5 d的细胞增殖曲线。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡

当shCtrl和shWNT10A组细胞生长至覆盖率约为70%时用胰蛋白酶消化，再用完全培养基重悬成细胞悬液；与上清细胞收集于同一5 mL离心管，每组设3个复孔(细胞数目≥5×10⁵)，以1 300 r/min离心5 min，弃上清；用4 ℃预冷的D-Hanks洗涤细胞沉淀，再用缓冲液洗涤细胞沉淀1次；以1 300 r/min离心3 min，收集细胞；用200 μL缓冲液重悬细胞沉淀；加入10 μL Annexin V-别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)染色，室温避光10~15 min；根据细胞量的不同，加入不同量的缓冲液，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9 MTT法检测细胞增殖

将处于对数生长期的shCtrl和shWNT10A组细胞用胰蛋白酶消化后，再用完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；以细胞密度2 000个/孔铺板，每组重复3次，铺5块96孔板，加入四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和DMSO溶解甲瓒颗粒，在显微镜下观察2组细胞的密度；用酶标仪在490 nm处检测OD值，并绘制细胞的生长曲线。

1.10 细胞划痕试验检测细胞迁移

将处于对数生长期的shCtrl组和shWNT10A组细胞用胰蛋白酶消化后，制成3×10⁴个/L的细胞悬液铺入96孔板；次日更换低浓度的血清培养基，用10 μL枪头在96孔板中央向上轻轻推移形成划痕，用荧光显微镜在0、12、24 h 3个时间点进行拍照；根据荧光显微镜拍摄的照片计算shCtrl组和shWNT10A组细胞的迁移率。

1.11 Transwell法检测细胞侵袭

将100 µL无血清培养基加入Transwell小室上室，用完全培养基重悬成细胞悬液，每孔细胞数为1×10⁵，铺板于24孔板；在Transwell下室加入30%胎牛血清的培养基600 µL，将无血清细胞悬液铺于96孔板中，每孔铺板5×10³个细胞，固定染色后在200倍视野下拍照并计数，分析shCtrl组和shWNT10A组细胞侵袭能力是否存在差异。

1.12 裸鼠荷瘤实验

将shCtrl和shWNT10A组细胞用胰蛋白酶消化后，再用完全培养基重悬制成细胞悬液，细胞密度为2×10⁷个/mL。将20只4周龄BALB/c雌性裸鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司)随机分为2组：NC组，即阴性对照组，右侧腋下皮下注射TPC-1细胞；KD组，即WNT10A基因干扰组，右侧腋下皮下注射shRNA-WNT10A-TPC-1细胞悬液。密切观察裸鼠成瘤情况并测量肿瘤大小。测量瘤体的最大径(a)、最小径(b)，用公式V=a×b²/2计算瘤体体积，绘制生长曲线。皮下注射15 d后，根据动物福利伦理规定，将裸鼠注射过量2%戊巴比妥钠安乐死，并进行颈椎脱臼确认死亡，取出肿瘤称重。

1.13 差异基因的识别及功能富集分析

选取敲减效率相对比较高的PTC细胞及对照组PTC细胞进行RNA测序，获得差异表达基因，绘制热图。将这些差异基因进行基因本体(Gene Ontology，GO)功能富集分析和独创性路径分析(ingenuity pathway analysis，IPA)。

1.14 蛋白质印迹法检测关键基因蛋白质水平的变化

用磷酸缓冲盐溶液将敲减WNT10A基因的K1细胞及对照组K1细胞洗涤2次，然后，用预先冷却好的2倍裂解缓冲液将细胞样品裂解，聚丙烯酰胺凝胶80 mA电泳20 min；分离胶120 mA电泳60 min，然后将目的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(4 ℃、电流300 mA)上；加入一抗孵育后，用TBST洗聚偏二氟乙烯膜；加入二抗孵育1.5 h后，用TBST洗聚偏二氟乙烯膜；拍摄X线片。

1.15 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，2组比较采用独立样本t检验；计数资料采用频数(率)表示，2组比较采用χ²检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 WNT10A在PTC组织中的表达

GEPIA和UALCAN数据库分析显示：WNT10A mRNA在甲状腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(均P<0.01，图1A和1B)。GEPIA数据库进一步分析发现WNT10A表达较高的甲状腺癌症患者总体生存率较差(P=0.018，图1C)。通过real-time RT-PCR评估的32对PTC组织和癌旁组织中，25例(78.13%)PTC组织中的WNT10A mRNA水平高于癌旁组织(图1D)。

免疫组织化学染色检测WNT10A在158例经外科手术切除且术后确诊为PTC癌组织及癌旁组织中的表达，结果显示WNT10A蛋白阳性表达颗粒主要定位于肿瘤细胞的细胞质中。癌旁组织中WNT10A为阴性表达或低表达(图1E)，其中103例(65.2%)为阴性表达、55例(34.8%)为低表达；所有PTC癌组织中WNT10A均为阳性表达(图1E)，其中93例(58.9%)高表达，65例(41.1%)低表达。与癌旁组织比较，癌组织的WNT10A染色积分明显增加(8.4±2.1 vs 4.3±1.8，P<0.01)。

2.2 WNT10A表达与临床病理特征的关系

WNT10A的表达水平与各临床病理因素之间的相关性结果显示：WNT10A的表达水平与性别(P=0.745)、年龄(P=0.886)、TNM分期(P=0.667)无显著相关性。然而，WNT10A的表达水平与病灶数目(P=0.034)、腺体外侵犯(P=0.018)和淋巴结转移(P<0.001)显著相关(表1)。

2.3 敲减 WNT10A 的表达对PTC细胞增殖的影响

Celigo结果显示：与shCtrl组比较，shWNT10A组K1和TPC-1细胞增殖均被明显抑制(均P<0.05，表2、图2)。

MTT结果显示：连续检测5 d后，与shCtrl组比较，shWNT10A组的K1和TPC-1细胞的增殖率受到显著抑制(P<0.01，图3)。

2.4 敲减 WNT10A 的表达增加PTC细胞的凋亡

流式细胞结果显示：与shCtrl组相比，shWNT10A组中凋亡期K1细胞的百分比显著增加(1.55%±0.08% vs 5.87%±0.04%，P<0.01；图4A)；与shCtrl组相比，shWNT10A组中凋亡期TPC-1细胞的百分比显著增加(0.98%±0.16% vs 45.84%±0.46%，P<0.01；图4B)。

2.5 敲减 WNT10A 的表达抑制PTC细胞的侵袭及转移

细胞划痕试验测定shCtrl和shWNT10A组K1细胞和TPC-1细胞愈合率，结果显示敲减WNT10A的shWN10A组K1细胞24 h愈合率为22%±3%，而shCtrl组K1细胞愈合率为36%±3%(P<0.01，图5A)；敲减WNT10A的shWN10A组TPC-1细胞24 h愈合率为27%±4%，而shCtrl组TPC-1细胞愈合率为48%± 5%(P<0.01，图5B)。

Transwell实验结果显示：敲减WNT10A的shWN10A组和shCtrl组K1细胞中侵袭细胞数分别为100±1.191和111±0.89(P<0.01，图6A)，shWN10A组和shCtrl组TPC-1细胞中侵袭细胞数分别为198±1.51和213±4.87(P<0.01，图6B)。

2.6 敲减 WNT10A 有效抑制裸鼠荷瘤瘤体的生长

20只4周龄雌性BALB/c裸鼠荷瘤实验显示：KD组、NC组均可见明显实体瘤，成瘤率为100%(图7A)。终末肿瘤体积：KD组为(404.11±172.14) mm³，NC组为(785.36±190.04) mm³，NC组体积大于KD组(P<0.01，图7B)。终末肿瘤质量：KD组为(0.458±0.205) g，NC组为(0.970±0.231) g，NC组肿瘤质量大于KD组(P<0.01，图7C)。

2.7 差异基因的识别及功能富集分析

与shCtrl组相比，转染WNT10A的敲减质粒能很大程度地抑制2种PTC癌细胞系中WNT10A的转录水平。在K1、TCP-1细胞中，shWNT10A的敲减效率分别为85%、76%(图8)。选取敲减效率相对比较高的K1细胞及对照组K1细胞进行RNA测序，共发现436个上调表达基因和609个下调表达基因(图9A)。将这些差异基因再进行GO分析和基于IPA的经典通路分析，发现较多的差异基因可富集到Tec激酶信号通路(图9B)，并且Tec激酶信号通路被显著抑制(图9C)。

2.8 Real-time RT-PCR及蛋白质印迹法验证WNT10A对Tec 激酶信号通路下游关键分子mRNA、蛋白质的表达影响

Real-time RT-PCR结果显示：特异性敲减K1细胞中WNT10A的表达水平，Tec激酶信号通路下游关键基因STAT3、MAPK8、TNFRSF21和AKT2的mRNA水平均出现不同程度的下调(均P<0.01，表3)。蛋白质印迹法结果显示：在K1细胞中特异性敲减WNT10A可以减少STAT3、MAPK8、TNFRSF21、AKT2蛋白的表达(图10)。

3 讨 论

Wnt基因是Nusse等^[14]于1982年发现并报道的。Wnt基因及其Wnt信号通路组成分子的突变可引起发育缺陷，异常的Wnt信号转导可导致肿瘤等疾病的发生。Wnt基因编码的蛋白质为350~400个氨基酸残基的分泌型糖蛋白。在哺乳动物中，Wnt基因家族成员有19种，它们通过与细胞表面和细胞外基质的联系而体现信使的作用，通过复杂的信号转导通路控制胚胎早期的发育，调节细胞的分化、增殖及生长^[15]。

WNT10A是Wnt家族中的重要成员，该基因定位于人类染色体2q35^[16]。研究^[17]表明：WNT10A基因过表达能够抑制脂肪生成，刺激成骨生成；WNT10A的缺失或突变会导致牙齿形态发生，牙本质发生，成牙细胞分化，毛囊发育，舌和汗腺乳头、指甲形成及表皮再生等缺陷。此外，WNT10A在多种恶性肿瘤中呈高表达，目前已有研究^{[9, 11-13, 18]}报道WNT10A在胃癌、结直肠癌、肾细胞癌、卵巢癌和子宫内膜癌等多种恶性肿瘤中均高表达。Li等^[11]通过分析86例卵巢癌患者的癌与癌旁组织，发现肿瘤组织中WNT10A的表达水平升高，WNT10A的过表达与卵巢癌的肿瘤临床分期、淋巴结转移有显著相关性，并且WNT10A表达水平降低的患者与升高的患者相比总体生存率有所提高。这表明WNT10A可能是卵巢癌患者生存率的预测因子。Oliveira等^[12]研究发现胃癌组织中WNT10A的表达明显高于癌旁正常组织，并且与肿瘤的直径、浸润的深度、TNM分期呈正相关，WNT10A高表达的患者5年生存率明显减低，表明WNT10A在胃癌的分化、进展、侵袭和转移中起重要作用，是评价胃癌生物学行为的良好指标。以上研究表明WNT10A基因表达异常上调与肿瘤的发生密切相关。本研究结果显示WNT10A在PTC癌组织中高表达，并与多灶性、腺外侵袭、淋巴结转移相关，这表明WNT10A基因的表达上调可能在PTC的发生、发展过程中发挥重要作用。

WNT10A作为Wnt家族的重要成员，与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移有关。Hsu等^[9]分别将肾细胞癌细胞系和组织与正常肾、良性肾病组织相比，发现肾细胞癌细胞系和组织中WNT10A表达均显著增加，WNT10A siRNA敲除可降低肾细胞癌细胞的增殖和侵袭性，表明WNT10A可诱导肾细胞癌细胞增殖和侵袭。Li等^[13]研究发现WNT10A在40例结直肠癌组织中呈高表达，在SW480、SW620和HCT116细胞系中也呈高表达；WNT10A敲除后，细胞增殖被抑制55%，Transwell试验中细胞迁移率降低50%。为了研究WNT10A对PTC的发生、发展是否存在调控作用，本研究选择K1和TPC-1细胞系进行探索，通过慢病毒介导的RNA干扰技术特异性敲减PTC细胞中WNT10A基因的表达，结果表明特异性敲减WNT10A的表达能够显著抑制PTC细胞的增殖、侵袭和迁移能力，能有效抑制裸鼠荷瘤瘤体的生长，与临床组织中的研究结果一致。

Tec酪氨酸激酶参与多种细胞因子的信号转导过程，是多种细胞因子、辅助分子及受体型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)信号转导过程中一个重要的靶分子^[18]。Tec能够与Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)或整合素、淋巴细胞表面抗原、G蛋白偶联受体、受体型PTK膜受体下游发生作用^[19]。同时，Tec可以被FAK家族激酶、JAK、Src和Syk等非受体型蛋白酪氨酸激酶调节。Tec还可以调节磷脂酰肌醇3-激酶通路、磷脂酶C通路及蛋白激酶C通路等多种主要信号转导路径^[20]。研究^[21]表明：Tec信号通路在肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌等多种癌症的发生、发展中发挥重要作用。本研究发现Tec激酶信号通路在PTC中被激活，并且依赖于WNT10A，因此推测Tec激酶信号通路可能在WNT10A介导的PTC的发生、发展过程中发挥重要作用。

综上所述，在PTC的发生、发展过程中，WNT10A基因的异常表达可能介导了PTC细胞的非正常增殖，导致PTC的增殖、侵袭和转移，其机制可能与抑制Tec激酶信号通路表达有关。检测WNT10A基因的表达可能有助于预测PTC潜在的侵袭、转移倾向，WNT10A可作为PTC患者潜在的治疗靶点。

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基金资助

国家自然科学基金(81871367)

湖南省自然科学基金(2022JJ30894)

湖南省卫生健康委员会课题(202209025123┫。This work was supported by the National Natural Science Foundation ┣81871367)

the Natural Science Foundation of Hunan Province(2022JJ30894)

the Project of Health Commission of Hunan Province(202209025123)

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