黄芪皂苷Ⅳ调控miR-21抑制Notch信号通路对骨质疏松症大鼠BMSCs成骨分化的影响

摘要

目的：骨质疏松症的核心病理是骨吸收超过骨形成，因此促进成骨成为关键的治疗策略。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化是骨形成的基础。黄芪皂苷Ⅳ(astragaloside Ⅳ,A-Ⅳ)作为中药黄芪的主要活性成分，其促进成骨的分子机制仍有待研究揭示。本研究旨在探讨A-Ⅳ对骨质疏松症大鼠BMSCs增殖与成骨分化的影响，并通过分析微RNA(microRNA,miR)-21与Notch2的表达变化，深入阐明其分子机制。方法：成熟雌性SD大鼠经1周适应性喂养后，随机分为假手术(Sham)组(n=4)和卵巢切除术(ovariectomy,OVX)组(骨质疏松症模型组；n=8)。术后12周分离、培养大鼠股骨髓腔内提取的BMSCs，并分为S-BMSCs组(来源于Sham组)、O-BMSCs组(来源于OVX组)和A-BMSCs组(来源于OVX组)，S-BMSCs组和O-BMSCs组的BMSCs使用成骨诱导培养基诱导其成骨分化，A-BMSCs组的BMSCs添加A-Ⅳ进行干预后诱导其成骨分化。采用流式细胞术鉴定S-BMSCs组和O-BMSCs组BMSCs的细胞表面间充质干细胞标志物CD29和造血干细胞标志物CD34的表达水平，确认间充质干细胞特性。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测BMSCs增殖活性。采用茜素红染色定量分析钙结节形成情况。采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测评估成骨分化水平。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)检测成骨相关基因[矮小相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)]和miR-21的表达变化，并通过蛋白质印迹法分析Runx2、OPN和Notch2蛋白质表达情况。结果：流式细胞术结果显示O-BMSCs组的BMSCs仍然符合BMSCs的细胞表面标志物特征。A-Ⅳ可显著促进骨质疏松症大鼠BMSCs的增殖(P<0.05)，并增强ALP活性，上调成骨分化Runx2和OPN基因和蛋白质表达水平(P<0.05)。且miR-21与Notch2存在靶向结合关系，A-Ⅳ能促进miR-21的表达，并抑制Notch信号通路关键受体Notch2蛋白表达水平(P<0.05)。结论：A-Ⅳ通过上调miR-21的表达，抑制Notch信号通路关键蛋白质Notch2的表达，从而解除Notch2对骨质疏松症来源BMSCs成骨分化的抑制作用，促进其向成骨分化。

关键词

黄芪皂苷Ⅳ / 骨质疏松症 / 骨髓间充质干细胞 / 成骨分化 / Notch信号通路