O-GlcNAc修饰的YTHDF2通过m⁶A修饰调节抑癌基因PER1促进膀胱癌的发展

摘要

目的：膀胱癌是一种常见恶性肿瘤，发病率高且预后较差。N⁶-甲基腺苷（N⁶-methyladenosine,m⁶A）修饰广泛参与各种生理过程，其中m⁶A识别蛋白YTH N⁶-甲基腺嘌呤RNA结合蛋白F2（YTH N⁶-methyladenosine RNA binding protein F2,YTHDF2）在膀胱癌进展中发挥重要作用。本研究深入探究O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc）修饰的YTHDF2调控下游靶基因周期昼夜节律调节器1（period circadian regulator 1,PER1）进而影响膀胱癌细胞增殖的分子机制。方法：采用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）预测YTHDF2在膀胱癌的表达。采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）、蛋白质印迹法或免疫组织化学染色检测YTHDF2、PER1和增殖相关蛋白质[增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、微小染色体维持复合体组分2（minichromosome maintenance complex component 2,MCM2）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1,CCND1）]在临床水平（20对膀胱癌和癌旁正常组织）和细胞水平[正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1）和膀胱癌细胞（T24、5637、EJ-1、SW780、BIU-87）]的表达。敲低5637和SW780细胞中的YTHDF2，采用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）、平板克隆和EdU检测细胞增殖情况。采用生物信息学预测YTHDF2的糖基化修饰位点，免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）检测临床组织及细胞中YTHDF2蛋白的O-GlcNAc修饰水平。采用DMSO、OSMI-1（抑制糖基化）、Thiamet G（促进糖基化）处理膀胱癌细胞并加入放线菌酮（cycloheximide,CHX）,IP检测YTHDF2泛素化水平。对膀胱癌细胞进行YTHDF2的敲低及Thiamet G处理，检测PER1 mRNA稳定性、PER1 m⁶A修饰及细胞增殖情况。TCGA网站预测组织中PER1的表达水平；SRAMP网站预测PER1可能存在的m⁶A修饰位点。甲基化RNA免疫沉淀（methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP）检测PER1 m⁶A修饰水平；最后检测敲低YTHDF2和PER1对5637和SW780细胞增殖的影响。结果：与癌旁正常组织比较，YTHDF2在膀胱癌组织中的mRNA表达水平上调2.5倍，蛋白质水平升高2倍，且O-GlcNAc修饰水平增加3.5倍（均P<0.01）。YTHDF2在膀胱癌细胞系中上调，且敲低YTHDF2抑制膀胱癌细胞活力（P<0.001），下调增殖相关蛋白PCNA、MCM2、CCND1的表达（均P<0.05），细胞克隆数较正常组降低3倍（P<0.01），抑制细胞增殖。YTHDF2在膀胱癌细胞中O-GlcNAc修饰水平升高。OSMI-1显著降低YTHDF2蛋白稳定性（P<0.01），促进其泛素化；Thiamet G则发挥相反作用（P<0.001）。添加Thiamet G可以逆转敲低YTHDF2引起的细胞功能变化，促进膀胱癌细胞增殖（P<0.01），上调PCNA、MCM2、CCND1的表达（均P<0.05）。YTHDF2靶向识别PER1 m⁶A修饰进而促进PER1 mRNA的降解。回复实验结果显示敲低PER1逆转敲低YTHDF2对膀胱癌细胞增殖的抑制，促进膀胱癌细胞增殖（P<0.001），上调PCNA、MCM2、CCND1的表达（均P<0.05），提示YTHDF2通过调节PER1促进膀胱癌细胞的增殖。结论：O-Glc NAc修饰的YTHDF2通过m6A修饰下调抑癌基因PER1，进而促进膀胱癌的发展。

关键词

膀胱癌 / O-连接N-乙酰葡萄糖糖基化 / N⁶-甲基腺苷修饰 / YTH N⁶-甲基腺嘌呤RNA结合蛋白F2 / 周期昼夜节律调节器