斑马鱼p2rx2基因敲除品系的构建与表型分析（英文）

摘要

目的：嘌呤能受体P2X2(purinergic receptor P2X2,P2RX2)基因编码对ATP敏感的离子通道，对Na+、K+和Ca2+等阳离子具有通透性(其中对Ca2+的通透性最高)。P2RX2受体功能丧失已被确定为常染色体显性遗传性耳聋41型(autosomal dominant nonsyndromic deafness 41,DFNA41)的致病原因，该疾病不仅使患者对噪声损伤更敏感，还表现为高频听力损失和老年性聋进程的加速。斑马鱼因其体型小、易饲养、发育快、繁殖力强、胚胎透明及与人类基因高度保守等优势，已成为研究人类疾病和发育机制的理想模式动物。本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑系统技术建立p2rx2基因敲除的斑马鱼模型，探究该基因缺失对听觉系统的影响，为深入解析P2RX2相关听力损失的分子机制及开发基因治疗策略提供基础。方法：选用实验室自繁Tübingen(TU)品系斑马鱼，在其p2rx2基因上设计2个间隔47 bp的靶位点[小向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)1和sgRNA2]。通过体外转录合成sgRNA，将其与Cas9蛋白按比例混合后显微注射至斑马鱼单细胞期受精卵中。培养至受精后36 h时随机抽取部分胚胎提取基因组DNA，经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增及凝胶电泳初步验证注射有效性。存活的胚胎继续培养至成鱼[初代(F0)]，剪尾取样，通过PCR及电泳进行基因型鉴定，筛选阳性嵌合体。将阳性F0与野生型斑马鱼杂交获得子一代(F1)杂合子，再通过自交获得子二代(F2)纯合突变体。利用PCR产物测序分析突变类型及遗传稳定性。针对受精后5天(5 days post-fertilization,5 dpf)的F2纯合突变体和野生型幼鱼，采用YO-PRO-1荧光染色观察侧线神经丘和耳石区毛细胞的形态与数量变化。另选取4月龄野生型和纯合突变体成鱼各9尾，检测其听觉诱发电位(auditory evoked potential,AEP)在600、800、1 000和2 000 Hz频率下的听觉阈值。结果：成功构建p2rx2基因敲除的斑马鱼模型。测序证实突变体在第1个靶位点前插入了66 bp序列，并在插入序列中引入了提前终止密码子(TAA)，导致蛋白质翻译提前终止和功能丧失。突变体胚胎发育正常，未见明显形态异常。YO-PRO-1染色显示，5 dpf突变体侧线神经丘毛细胞在数量和排列上与野生型无显著差异，但耳石区毛细胞密度明显降低。AEP检测结果表明，纯合突变体在600、800、1 000和2 000 Hz频率下的听觉阈值均显著高于野生型(均P<0.001)，表明其听力敏感性全面下降。结论：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统技术成功建立了具有稳定遗传性的p2rx2基因功能丧失突变体斑马鱼模型，证实了p2rx2基因缺失会导致耳石区毛细胞发育缺陷和全频段听觉阈值升高，提示p2rx2在斑马鱼听觉毛细胞功能维持和听力感知中发挥关键作用。值得注意的是，突变仅影响耳石区而不影响侧线系统的毛细胞，表明p2rx2在不同感觉器官中的功能可能具有差异性。该模型为深入研究P2RX2相关听力损失的病理机制、筛选耳保护药物及开发基因治疗策略提供了有价值的实验工具。

关键词

斑马鱼 / p2rx2 / 嘌呤能受体P2X2 / CRISPR/Cas9系统 / 毛细胞