UPLC-MS/MS测定生物样本中替来他明及其代谢物方法的建立及应用

摘要

目的：兽用麻醉剂替来他明为新型毒品替代物，在全球多地区出现滥用情况，对公众健康造成巨大危害，但其检测方法的灵敏度难以满足法医学实践需求。本研究旨在建立一种测定人体生物样本中替来他明及其代谢物去乙基替来他明的超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）法，并通过方法学验证其能否应用于法医学实践。方法：选择SKF_525A为内标，采用乙腈(含1 ng/mL SKF_525A)萃取生物样本，漩涡振荡10 min，超声处理20 min，以10 000 r/min离心10 min，取500μL上清液经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱系统（ACQUITY UPLC H-Class PLUS）和三重四极杆质谱仪（XEVO TQ-S Micro）进行检测。色谱条件采用ACQUITY UPLC^?BEH C18（1.7μm, 2.1 mm×100 mm）色谱柱，0.3 mL/min流速，考察4种流动相体系（20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液+甲醇、20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液+乙腈、水+甲醇、水+乙腈）对替来他明及去乙基替来他明的分离效果。质谱条件采用电喷雾离子源正离子模式（electrospray ionization in positive mode,ESI+）、多反应监测模式（multiple reaction monitoring,MRM），替来他明和去乙基替来他明分别选用质荷比为224.043→179.016、196.08→151.06作为定量离子对。以添加0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL替来他明的血样的质谱响应值为纵坐标，替来他明浓度为横坐标，通过最小二乘法进行线性回归获得校准曲线，考察替来他明在血样中的线性范围、检出限和定量限；选取替来他明低（5 ng/mL）、中（20 ng/mL）、高（100 ng/mL）3种浓度制备多份血液、肝脏及肾脏的阳性添加样本和空白样本，经前处理后上机进行检测分析并记录其响应值，考察替来他明在不同生物样本中的精密度、准确度、基质效应、提取回收率和稳定性。最后，采用UPLC-MS/MS定量检测实际案例获取的替来他明样本，以验证其适用性。结果：建立的UPLC-MS/MS法可同时检测人体生物样本中的替来他明及代谢物去乙基替来他明，保留时间分别为3.42 min和2.82 min。以流动相A（20 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液）和流动相B（乙腈）梯度洗脱替来他明和去乙基替来他明的效果最佳。血液样品中替来他明在0.1～200 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数r=0.992，决定系数R²=0.983，检出限为0.03 ng/mL，定量限为0.1 ng/mL，提取回收率为92%～107%，基质效应为71%～99%；肝脏样本中的提取回收率为91%～98%，基质效应为69%～96%；肾脏样本中的提取回收率为93%～104%，基质效应为72%～100%。本方法在不同样本中的日内、日间精密度[以相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）表示]和准确度[以相对误差（relative error,RE）表示]均控制在15%以内，且样本在-20℃冻存条件下表现出良好的稳定性。从实际案件获取的生物样本中检测到替来他明成分：案例1血液、肝脏、肾脏样本含量分别为0.37μg/mL、0.15μg/g、0.11μg/g，案例2血液样本含量为8.75 ng/mL；在血样中检测到代谢物去乙基替来他明成分。结论：UPLC-MS/MS法高效、准确、灵敏，适用于人体生物样本中替来他明和代谢物去乙基替来他明成分的检测。

关键词

法医毒理学 / 新精神活性物质 / 替来他明 / 去乙基替来他明 / 生物样本