ANXA2协同NF-κB的正反馈调控环路促进高糖诱导的肾小管上皮细胞焦亡

摘要

目的：细胞焦亡在糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)肾小管间质病变中发挥重要作用。膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)参与细胞增殖、凋亡和黏附，可能与DKD密切相关，但具体机制尚不清楚。本研究探讨ANXA2在高糖诱导的肾小管上皮细胞焦亡中的作用及分子机制，为DKD的防治提供新的靶点。方法：将人肾小管上皮细胞系HK-2细胞随机分为正常组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30.0 mmol/L葡萄糖)和高渗对照组(24.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L葡萄糖)。通过转染过表达质粒和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)调控ANXA2表达，并分别采用5-乙炔基-2-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)法检测细胞增殖，流式细胞术分析细胞凋亡率，以及免疫荧光观察ANXA2、p50、p65的亚细胞定位。采用蛋白质印迹法检测纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(alphasmooth muscle actin,α-SMA)、纤连蛋白(fibronectin,FN)、Ⅳ型胶原(collagen type IV,Col-IV)的表达，实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)和蛋白质印迹法分析核转录因子(nuclear factor-κB,NF-κB)亚基p50、p65和焦亡通路因子NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family Pyrin domain containing 3,NLRP3)、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18的mRNA和蛋白质表达情况。采用免疫共沉淀实验分析ANXA2与p50、p65的蛋白质相互作用情况，染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)和双荧光素酶报告基因实验探讨NF-κB与ANXA2启动子结合情况。结果：高糖诱导能上调HK-2细胞中ANXA2的表达并促进其核转位，差异有统计学意义(P<0.01)。高糖处理后，HK-2细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，α-SMA、FN和Col-IV的蛋白质表达水平均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；过表达ANXA2后会进一步加剧上述指标变化，差异均有统计学意义(均P<0.05)；采用siRNA干扰ANXA2表达后，可部分逆转细胞增殖率下降、凋亡率升高以及纤维化程度，差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖处理可激活NF-κB并上调NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白质表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)；过表达ANXA2会进一步增强这一效应，而干扰ANXA2表达则抑制NF-κB活化及其下游因子的表达，差异均有统计学意义(均P<0.05)。免疫共沉淀实验证实ANXA2与NF-κB亚基p65直接结合，而ChIP实验显示NF-κB亚基p65特异性结合ANXA2启动子的ChIP-2、ChIP-4、ChIP-6区域(富集倍数>1)，且以此构建对应的突变型M2、M4、M6组的荧光素酶活性较空载体对照组均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，进一步证实p65正向调控ANXA2的转录。结论：ANXA2与NF-κB形成正反馈环路，通过持续激活NLRP3炎症小体，促进焦亡相关通路活化，加剧高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。靶向ANXA2或阻断其与p65的相互作用有望成为延缓DKD进展的新策略。

关键词

糖尿病肾病 / 细胞焦亡 / 膜联蛋白A2 / 核转录因子κB / 正反馈环路 / NLR家族Pyrin域蛋白3