星形胶质细胞通过Cx47调控外泌体介导的CHI3L1分泌并促进少突胶质前体细胞增殖

摘要

目的：神经退行性变性疾病与髓鞘缺失紧密相关，而少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的增殖和分化是髓鞘修复的关键，但其调控机制尚未完全明确。本研究旨在探讨星形胶质细胞(astrocytes,ASTs)通过间隙连接蛋白47(connexin 47, Cx47)调控外泌体介导的几丁质酶3样蛋白1(chitinase-3-like protein 1,CHI3L1)分泌及其对OPCs增殖的影响机制。方法：采用清洁的出生后第1天斯普拉格-道利(postnatal day 1 SpragueDawley,P1SD)乳鼠原代细胞，建立OPCs与ASTs上清液共培养组(A组)、ASTs与OPCs直接接触培养组(C组)及OPCs单独培养组(O组)。采用光学显微镜、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)掺入及流式细胞术评估细胞状态和增殖能力。采用转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)和生物信息学分析(bioinformatics analysis,BA)筛选3组中OPCs的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。采用蛋白质印迹(Western blotting,WB)和流式细胞术分析各培养组蛋白质表达和细胞周期。采用差速离心法分离、提纯外泌体，通过纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)、透射电子显微镜分析观察OPCs分泌的外泌体数量和质量，采用WB验证外泌体中CHI3L1的表达水平。采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术敲除Cx47，评估敲除后OPCs增殖能力和外泌体分泌情况。构建包裹CHI3L1的小单层脂质体(single unilamellar vesicles,SUVs)作为人工外泌体模型，采用NTA和电子显微镜鉴定其结构和尺寸。在敲除Cx47后，补充人工外泌体并采用流式细胞术和EdU试验检测OPCs增殖情况。结果：在直接接触共培养条件下，相较于O组和A组，C组OPCs增殖最为显著(P<0.05)。RNA-Seq和WB分析结果显示，ASTs通过Cx47显著促进OPCs的增殖，并增强富含CHI3L1的外泌体的分泌。在采用siRNA技术抑制Cx47表达后，OPCs增殖活性以及外泌体释放量均显著降低(P<0.05)；再次补充分离提纯的外泌体和外源性CHI3L1后，采用siRNA技术敲除Cx47对OPCs细胞增殖的抑制作用被削弱。结论：本研究揭示了ASTs通过Cx47调控OPCs增殖的新途径，ASTs在直接接触OPCs时通过Cx47增强富含CHI3L1的外泌体分泌，将细胞间接触信号转化为分泌信号，从而促进OPCs增殖。CHI3L1作为外泌体中的关键分子，在神经系统中的功能和髓鞘修复中的作用机制值得深入研究。

关键词

少突胶质前体细胞 / 星形胶质细胞 / 间隙连接蛋白47 / 外泌体 / 几丁质酶3样蛋白1 / 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 / 转录组测序 / 差异表达基因 / 细胞增殖