自主研发的藏四味清肺合剂雾化对香烟烟雾诱导的COPD小鼠气道炎症的影响及网络药理学分析

摘要

目的：慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)发病率和病死率高，严重危害患者的生活质量，造成了严重的经济及公共卫生负担，以COPD为首的慢性呼吸系统疾病已被世界卫生组织列为全球四大慢性病。藏四味清肺合剂(Zangsiwei Qingfei Mixture,ZSWQF)是本研究团队自主研发的全新藏药处方合剂，用以治疗慢性呼吸系统疾病。本研究旨在探讨ZSWQF雾化吸入对香烟烟雾诱导的COPD小鼠气道炎症的影响及其潜在作用机制。方法：30只C57小鼠随机分为对照组、COPD组和ZSWQF组；其中对照组小鼠不进行烟熏干预，雾化吸入生理盐水；COPD组和ZSWQF组小鼠均进行烟熏干预，前者雾化吸入生理盐水，后者雾化吸入ZSWQF治疗。采用全自动血液细胞分析仪进行白细胞(white blood cell,WBC)计数；采用酶联免疫吸附试验检测血清丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)、血清肌酐(serum creatinine, SCr)及血清和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平；采用血球计数仪对BALF中的细胞进行分类计数；采用小动物肺功能测定仪检测气道阻力(airway resistance,RI)、循环动态顺应性(cyclic dynamic compliance, CyDN)等指标评价小鼠的肺功能；最后取小鼠肺组织固定，苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色后，采用平均线性截距(mean linear intercept,MLI)和破坏指数(destruction index,DI)评价小鼠肺组织形态学变化。收集疾病相关靶标和ZSWQF组分相关靶标，对交集靶点和蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络进行分析，并进行功能和通路富集分析。原代提取分离SD大鼠II型肺泡上皮细胞(type II alveolar epithelial cell,AEC II)细胞并分为对照(Control)组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组、正常血清(Normal)组、ZSWQF水提物(water extracts of ZSWQF,W-ZSWQF)组、ZSWQF组和MLN-4760[血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)2抑制剂]组。采用蛋白印迹法分析ACE、 p38[一种丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)]、磷酸化(phospho, p)-p38、胞外信号调节激酶1/2(extracellular signalregulated kinases 1 and 2,ERK1/2)、p-ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p-JNK、核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor-kappa B alpha,IκBα)、p-IκBα、p-核因子κB p65亚基(p65 subunit of nuclear factor-kappa B,NF-κBp65)的蛋白质表达水平。结果：COPD组WBC计数高于对照组(P<0.01);ZSWQF组WBC计数低于COPD组(P<0.05);3组小鼠脏器重量、ALT和sCr差异均无统计学意义(均P>0.05);3组血清及BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平及细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数比较，COPD组均高于对照组，ZSWQF组均低于COPD组(均P<0.05)。COPD组肺功能RI高于对照组，CyDN低于对照组(均P<0.05)。COPD组小鼠肺泡腔严重充血，炎症细胞大量浸润，肺泡间隔与肺泡壁增厚，MLI和DI均高于对照组(均P<0.05);ZSWQF组的MLI和DI均低于COPD组(均P<0.05)。通过网络药理学分析确定了151个靶点作为ZSWQF治疗COPD的潜在靶点，核心靶点为TNF、IL-6、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)1、白蛋白(albumin,ALB)、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、非受体型酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinase,SRC)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、信号转导及转录活化因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9、β-联蛋白(beta-catenin,CTNNB1)，可能通过癌症通路、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt、低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1、钙和MAPK等信号通路发挥治疗COPD的作用。蛋白质印迹法结果表明：与LPS组相比，经ZSWQF含药血清干预后的AEC II细胞的ACE、p-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK、p-IκBα/IκBα、p-NF-κBp65水平明显降低，ACE2水平升高。这表明ZSWQF可以影响MAPK/核因子κB(nuclear factorkappa B,NF-κB)信号通路，与网络药理学分析结果一致。结论：ZSWQF雾化吸入对COPD小鼠具有较好的抗炎、减轻气道重塑的保护作用。

关键词

慢性阻塞性肺疾病 / 藏四味清肺合剂 / 雾化吸入 / 抗炎 / 白细胞介素-6 / 网络药理学