衣康酸通过抑制神经损伤诱导蛋白1介导的质膜破裂减轻脓毒症急性肺损伤巨噬细胞泛凋亡

摘要

目的：脓毒症急性肺损伤（sepsis-associated acute lung injury,S-ALI）是加强监护病房（intensive care unit,ICU）患者的重要致死原因之一，其发病机制尚未完全阐明，仍缺乏有效的治疗措施。巨噬细胞溶解性细胞死亡是SALI炎症级联反应的关键病理机制。其中，泛凋亡（PANoptosis）是以泛凋亡小体组装及激活为特征的新型溶解性细胞死亡方式，而神经损伤诱导蛋白1（ninjurin 1,NINJ1）作为一种新型膜成孔蛋白，在泛凋亡质膜破裂（plasma membrane rupture,PMR）中发挥关键作用。衣康酸在机体抗炎反应中发挥重要作用，但衣康酸在S-ALI巨噬细胞泛凋亡中的作用仍未阐明。本研究通过探讨衣康酸对S-ALI巨噬细胞泛凋亡的影响，旨在为治疗S-ALI提供新思路。方法：采用6～8周龄、体重18～20 g雄性无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级C57BL/6J小鼠为实验对象，经腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）建立经典S-ALI小鼠模型；采用蛋白质印迹法观察S-ALI模型小鼠肺组织泛凋亡小体相关蛋白质的表达变化，蛋白质印迹法、实时逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription polymerase chain reaction,real-time RT-PCR）及糖代谢组学检测S-ALI模型小鼠肺组织内衣康酸代谢途径相关酶表达及衣康酸含量的变化。采用原代腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages,PMs）开展细胞水平实验；采用衣康酸衍生物4-辛基衣康酸酯（4-octyl itaconate, 4-OI）预处理小鼠原代PMs，加入肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）和γ干扰素（interferon gamma,IFN-γ）诱导巨噬细胞泛凋亡。采用细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8,CCK-8）评估4-OI对巨噬细胞的毒性作用；蛋白质印迹法检测泛凋亡巨噬细胞衣康酸代谢途径相关酶的表达和4-OI对泛凋亡巨噬细胞泛凋亡小体相关蛋白质表达的影响，检测S-ALI模型小鼠肺组织内及泛凋亡巨噬细胞NINJ1蛋白的表达；活细胞染料FM_4-64荧光染色检测4-OI处理对泛凋亡巨噬细胞PMR的改变，免疫荧光染色检测4-OI对泛凋亡巨噬细胞NINJ1蛋白表达及膜定位的影响；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测4-OI对培养液上清及外周血血清中LDH释放的影响；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测S-ALI小鼠肺组织内NINJ1多聚体形成和4-OI对泛凋亡巨噬细胞NINJ1多聚体蛋白质表达的影响。结果：S-ALI模型小鼠肺组织中泛凋亡小体[NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）、 Gasdermin D（GSDMD）、 Z-DNA结合蛋白1（Z-DNA binding protein 1,ZBP1）、胱天蛋白酶（caspase）-1和caspase-3]相关蛋白质表达显著上调，混合系蛋白激酶样结构域蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL）S345磷酸化水平升高（均P<0.05），糖代谢组学显示衣康酸含量代偿性升高；泛凋亡巨噬细胞衣康酸合成酶顺乌头酸脱羧酶1（aconitate decarboxylase 1,ACOD1）m RNA和免疫应答基因1（immunoresponsive gene 1,IRG1）蛋白质表达均显著上调（均P<0.01）。4-OI可显著抑制泛凋亡巨噬细胞泛凋亡小体相关蛋白质的表达，逆转泛凋亡巨噬细胞培养液上清LDH的释放，恢复质膜完整性。同时，4-OI可显著抑制泛凋亡巨噬细胞成孔膜蛋白NINJ1的表达及其在细胞膜上寡聚。结论：衣康酸可能通过抑制成孔蛋白NINJ1介导的PMR减轻巨噬细胞泛凋亡，本研究结果有望为S-ALI临床治疗提供新思路。

关键词

脓毒症急性肺损伤 / 巨噬细胞 / 泛凋亡 / 衣康酸 / 质膜破裂 / 神经损伤诱导蛋白1