载锌氧化镁纳米颗粒在谷氨酸兴奋性毒性青光眼模型中的视网膜保护作用

摘要

目的：青光眼的病理特征主要表现为视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的进行性丧失。目前针对青光眼尚缺乏有效的RGCs保护策略，纳米材料是有潜力的药物递送载体。本研究旨在探索载锌氧化镁纳米颗粒(MgO-Zn2+nanoparticles,MgO-Zn NPs)对谷氨酸诱导RGCs损伤的作用，并评价其体内外生物相容性及神经保护潜能。方法：制备MgO-Zn NPs。通过透射电子显微镜及能谱分析等对MgO-Zn NPs进行表征。体外实验以大鼠视网膜前体细胞系R28为研究对象，采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)法系统评估MgO-Zn NPs的细胞毒性。体内实验以C57/BL小鼠为研究对象，通过玻璃体内注射N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)建立小鼠视网膜兴奋毒性模型，并用MgO-Zn NPs干预。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色评估小鼠视网膜RGCs的数量及凋亡情况。采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色检查小鼠的视网膜层结构。采用闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential,F-VEP)评价RGCs视觉传导功能。对小鼠视网膜组织进行RNA测序，分析差异表达基因的通路及功能，并进一步验证小鼠视网膜组织相关蛋白质表达水平的差异。结果：透射电子显微镜及能谱分析成功证实了MgO-Zn NPs的形貌及成分特征，确认复合物制备成功。CCK-8检测结果表明：75µg/mL MgO-Zn NPs对R28细胞无毒性。体内实验发现：小鼠玻璃体腔内注射MgO-Zn NPs溶液后，其眼表和角膜均未出现明显不良反应，显示其良好的眼部耐受性。TUNEL染色结果显示：视网膜兴奋毒性模型小鼠的RGCs数量较正常小鼠显著减少(P<0.05)，表明模型建立成功；而MgO-Zn NPs干预后显著减少了NMDA诱导的RGCs凋亡(P<0.05)。HE染色表明：MgO-Zn NPs干预后模型小鼠视网膜层结构得到部分恢复(P<0.05)。F-VEP测量结果显示：模型小鼠的P2波潜伏期增长、振幅降低(均P<0.001)，接受MgO-Zn NPs干预的模型小鼠P2波的潜伏期和振幅均得到一定程度的恢复(均P<0.05)。RNA测序结果表明：MgO-Zn NPs改善了NMDA诱导的视网膜转录组异常，差异表达基因主要与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路相关。免疫荧光染色结果显示：MgO-Zn NPs干预显著降低了模型小鼠视网膜组织的p-Akt和p-mTOR的表达水平(均P<0.01)。结论：MgO-Zn NPs既可保护视网膜神经元，又可作为眼内药物递送载体，有望作为具有双重功能的青光眼治疗候选药物。

关键词

锌 / 氧化镁纳米颗粒 / 谷氨酸兴奋毒性 / 青光眼 / 视网膜神经节细胞