LncRNA AK154753通过miR-345-3p/Bak和miR-708-5p/Bim介导急性肾缺血再灌注损伤的发生（英文）

摘要

目的：急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是以肾功能突然恶化为特征的临床综合征，肾缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是AKI最常见的病因。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)可通过与微RNA(micro RNA,miRNA)及信使RNA(messenger RNA,m RNA)相互作用调控细胞命运，但其在肾IRI导致的AKI中的具体作用网络及机制尚未阐明。本研究在系统筛选IRI肾组织中差异表达RNA的基础上，探讨lncRNA AK154753(AK154753)通过miR-345-3p/Bcl-2同源拮抗剂/杀伤蛋白(Bcl-2 homologous antagonist/killer,Bak)和miR-708-5p/Bcl-2相互作用介质蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)轴介导急性肾IRI的分子机制。方法：将小鼠双侧肾动脉缺血30 min并分别再灌注24 h与48 h以构建IRI模型，获取肾组织样本，结合芯片微阵列技术进行转录组测序并分析差异表达的lncRNA、miRNA及mRNA。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)对AK154753、miR-345-3p、miR-708-5p、Bak和Bim的RNA水平进行验证。为模拟体外肾缺血再灌注环境，在小鼠近端肾小管上皮细胞(BUMPT)中建立氧糖剥夺/再灌注(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型，检测相关RNA与凋亡蛋白的变化。利用腺相关病毒介导的shRNA敲低AK154753以评估其在体内的作用。采用TUNEL染色及流式细胞术检测肾组织损伤情况及细胞凋亡水平；蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bak、Bim、 cleaved-caspase3等的蛋白质水平；荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术定位AK154753在细胞内的分布。通过双荧光素酶报告基因验证AK154753与miR-345-3p/Bak及miR-708-5p/Bim之间的关系，并通过miRNA模拟物与抑制物探讨该调控网络的完整性。结果：IRI显著导致血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)水平升高，并伴随明显的肾小管结构损伤和细胞凋亡增加(均P<0.05)。转录组测序结合real-time RT-PCR验证结果显示：IRI后AK154753及促凋亡蛋白Bak和Bim表达均显著上调，而miR-345-3p和miR-708-5p表达均显著下调(均P<0.01)。体外实验中，OGD/R处理显著诱导肾小管上皮细胞中AK154753表达水平升高，并下调miR-345-3p和miR-708-5p的表达，同时显著上调Bak、Bim及cleaved-caspase-3的蛋白质表达水平，导致细胞凋亡明显增加(均P<0.01)。沉默AK154753可显著减轻OGD/R诱导的细胞凋亡，降低Bak、Bim及cleaved-caspase 3的表达，减少细胞凋亡，并显著上调miR-345-3p和miR-708-5p的表达水平(均P<0.01)。体内实验结果显示：腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的AK154753沉默显著改善IRI小鼠的肾功能，减轻肾小管损伤并抑制肾组织细胞凋亡；表现为BUN和Scr水平显著下降、肾组织病理损伤评分明显改善，以及Bak、Bim和cleaved-caspase 3的表达水平显著降低，同时miR-345-3p和miR-708-5p的表达水平明显升高(均P<0.01)。荧光素酶报告实验进一步证实，miR-345-3p可直接结合AK154753与Bak的3'非翻译区(3'untranslated region,3'-UTR)，而miR-708-5p可直接结合AK154753与Bim的3'-UTR。抑制miR-345-3p或miR-708-5p可逆转AK154753沉默所产生的抗凋亡效应，并恢复Bak和Bim的表达水平(均P<0.01)。结论：AK154753在急性IRI过程中表达上调，并通过下调miR-345-3p和miR-708-5p的表达从而上调Bak与Bim的表达，促进细胞凋亡，参与急性肾IRI的发生、发展。

关键词

急性肾损伤 / 缺血再灌注 / 长链非编码RNA / 微RNA / 细胞凋亡