肥胖非酒精性脂肪肝病儿童肠道菌群16S rRNA基因高变区V3～V4和V4测序结果比较

摘要

目的：16S rRNA基因测序是研究样本微生物结构的重要方法，然而，对同一样本选择不同高变区进行测序是否会对结果产生影响尚不清楚。本研究旨在比较肥胖非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)儿童16S rRNA基因高变区V3～V4和V4测序结果的差异，为科学评估肥胖NAFLD儿童肠道菌群检测结果提供依据。方法：选择2020年1月至2021年9月在湖南省儿童医院就诊的肥胖NAFLD儿童和单纯肥胖儿童作为研究对象，采集粪便标本，提取样本总DNA，分别对肠道菌群V3～V4区和V4区进行PCR扩增后测序，比较2个高变区扩增后α和β多样性及菌群结构差异。选择7例样本进行宏基因组测序，以此作为金标准评价V3～V4区和V4区测序的优劣。结果：共纳入145例研究对象，其中92例为病例组，53例为对照组。V3～V4区测序获得的操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)数目(16 977)高于V4区测序(3 362)。α多样性分析结果显示，总人群V3～V4区Shannon指数(5.49±1.11)与Chao 1指数(1843.04±580.78)均高于V4区Shannon指数(4.98±0.65)与Chao 1指数(379.59±47.27)(均P<0.001)。β多样性分析结果显示，V3～V4区和V4区获得的菌群结构整体存在差异，且组间差异大于组内差异(P<0.05)。Welch's t检验结果显示，总人群V3～V4区和V4区测序在门、纲、目、科、属各水平检出的差异性菌群数目分别为2、9、35、33、72；病例组V3～V4区和V4区测序在各水平的差异性菌群数目分别为1、9、32、35、66；对照组V3～V4区和V4区测序在各水平的差异性菌群数目分别为0、7、27、21、0。线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析结果显示，V3～V4区测序共发现29种菌群在病例组与对照组之间存在差异，V4区测序共发现7种菌群在病例组与对照组之间存在差异(均P<0.01)。敏感性分析显示，V3～V4区测序(5.41±1.62)与宏基因组测序(6.39±0.42)的Shannon指数的差异无统计学意义(P=0.169)、 V3～V4区测序(1 889.92±781.73)的Chao 1指数小于宏基因组测序(3 092.71±505.89)，差异有统计学意义(P<0.01)。V4区测序的Shannon指数和Chao 1指数均小于宏基因组测序，差异有统计学意义(分别4.89±0.94 vs 6.39±0.42,362.41±35.22 vs 3 092.71±505.89，均P<0.01)。结论：16S rRNA基因的V3～V4区和V4区测序对研究肥胖儿童肠道菌群结构的结果有影响，V3～V4区更可能发现病例组与对照组之间的差异菌群，且对α多样性有更为准确的估计，可作为NAFLD儿童肠道菌群测序优先考虑的区域，但目前对16S rRNA基因测序V区的选择并无统一标准，要根据研究目的和样本特征综合选择检测区域和方法。

关键词

肥胖儿童非酒精性脂肪肝病 / 肠道菌群 / 16S rRNA基因测序 / V3～V4区 / V4区 / 宏基因组测序