ASS1联合LOLA治疗小鼠高氨血症的疗效

摘要

目的：精氨酸代琥珀酸合成酶1（argininosuccinate synthase 1,ASS1）是尿素循环的关键限速酶且蛋白质高度保守，其催化活性直接决定血氨的清除效率。高氨血症（hyperammonemia）是血氨异常升高引起的、以中枢神经系统功能障碍为主要表现的临床综合征，具有神经毒性和较高病死率。肝功能受损或尿素循环关键酶缺陷时，清除血氨能力下降，导致血氨蓄积并透过血脑屏障，引发意识障碍、昏迷甚至死亡。目前临床常用降氨药物中，门冬氨酸鸟氨酸（L-ornithine-L-aspartate,LOLA）可促进尿素循环降低血氨并保护肝，但高剂量易致胃肠道不良反应，限制其应用。本研究通过原核表达获得具有生物活性的人源ASS1蛋白，解析其酶促动力学特性，旨在探讨ASS1联合LOLA的降血氨作用，为临床高氨血症的治疗提供新的思路和潜在的酶学干预策略。方法：通过逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）扩增获得人源ASS1的开放阅读框全长，并对该PCR产物及pET-28a载体进行酶切。经琼脂糖凝胶电泳回收纯化上述片段后，利用同源重组技术成功构建了pET-28a-ASS1原核表达载体。随后转化至大肠杆菌中表达并使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导6×His-ASS1重组蛋白表达，采用镍柱亲和层析（nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA）进行蛋白质纯化。通过体外酶活实验验证重组蛋白的生物活性，构建以瓜氨酸（citrulline,Cit）和天冬氨酸（aspartate,Asp）为底物的酶促反应体系，测定ASS1的最适温度和最适pH反应条件，并进一步解析其酶促动力学参数。构建NH4Cl（腹腔注射400 mg/kg）诱导的C57BL/6小鼠高氨血症模型，检测ASS1联合LOLA降血氨作用，随机分组，建模4 h后经尾静脉给予ASS1、LOLA或联合干预4 h，并检测血氨与尿素水平；另设ASS1和LOLA联合用药对C57BL/6正常小鼠给药24 h后检测肝功能及肾功能指标。结果：采用同源重组技术成功构建并获得pET28a-ASS1载体，并在原核表达系统中获得可溶性重组蛋白ASS1；经Ni-NTA亲和层析纯化和浓缩后，蛋白质纯度达95.4%±1.2%，浓度为（10.5±0.8） mg/mL。在体外酶活实验中系统解析了ASS1的酶促反应特性，显示ASS1酶促反应的最适温度为37℃，最适pH值为8.0；结合底物Asp和Cit测定其酶促动力学参数，ASS1与Asp和Cit的K_m和k_cat/K_m分别为（31.00±1.24）μmol/L,2.07 L/（μmol·s）和（46.53±2.75）μmol/L,1.35 L/（μmol·s）；在体内实验中，通过腹腔注射400 mg/kg NH₄Cl建立急性高氨血小鼠模型，ASS1（50 mg/kg）可通过加速尿素循环降低血氨浓度，使血氨浓度下降48.86%;ASS1（50 mg/kg）与低剂量LOLA（50 mg/kg）联合给药时，降氨效率进一步提升，血氨浓度下降76.31%，并可使高氨血症小鼠的血氨水平恢复至正常范围。结论：通过原核表达获得的重组蛋白ASS1具有稳定且明确的生物活性，其催化功能受温度和pH条件显著影响，并呈现出清晰的酶促反应动力学特征。在NH4Cl诱导的小鼠高氨血症模型中，ASS1与LOLA联合应用较单独用药表现出更稳定的降血氨效果，显示出良好的协同作用，为高氨血症的治疗提供了新的酶学干预思路，进而为发展联合降血氨策略奠定了理论依据，并具有潜在应用前景。

关键词

精氨酸代琥珀酸合成酶1 / 原核表达与纯化 / 门冬氨酸鸟氨酸 / 高氨血症小鼠模型 / 降血氨作用