栀子苷通过Hspa1a通路抑制青光眼视网膜细胞凋亡

摘要

目的：青光眼是全球首位不可逆性致盲眼病，降低患者眼内压是目前最有效的治疗手段之一。然而，降低眼内压并不能完全阻止视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)死亡及其导致的视力丧失。中药在青光眼治疗中的应用已得到广泛论证，本研究拟探究栀子苷对视网膜细胞死亡的保护作用，以明确栀子苷在青光眼治疗中的潜在价值。方法：细胞试验：将视网膜R28细胞分为对照(CTL)组、氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)组、OGD/R+栀子苷(OGD/R+Gen)组、OGD/R+栀子苷+热激蛋白家族A成员1A(heat shock protein family A member 1A,Hspa1a)-小干扰RNA(OGD/R+Gen+H-KD)组。首先采用蛋白质组学技术筛选栀子苷干预后变化的关键分子，继而通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)和蛋白质印迹法筛选和检测栀子苷和H-KD干预后相关分子变化。然后通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试验检测栀子苷和H-KD干预后细胞活力和死亡情况，并采用流式细胞术、活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测和原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)染色检测栀子苷和H-KD干预后细胞凋亡情况。动物造模：将SD大鼠分为假手术对照(CTL)组、急性高眼压(acute high intraocular pressure,aHIOP)组、aHIOP+栀子苷(aHIOP+Gen)组、aHIOP+栀子苷+Hspa1a抑制剂apoptozole(aHIOP+Gen+Apo)组，并采用苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色、 TUNEL染色及闪光视网膜电图(flash electroretinogram,f ERG)评估各组大鼠的视网膜结构、细胞凋亡和功能变化。结果：1)蛋白组学技术联合qPCR和蛋白质印迹法筛选出Hspa1a水平在栀子苷干预后明显升高。2)与OGD/R组比较，OGD/R+Gen组细胞活力增强(P<0.05)、死亡细胞减少(P<0.05)、 ROS水平降低(P<0.001)、凋亡细胞数减少(P<0.05)。3)与OGD/R+Gen组比较，OGD/R+Gen+H-KD组p-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)表达降低(P<0.01)，同时细胞活力降低(P<0.05)、死亡细胞增加(P<0.05)、ROS水平升高(P<0.01)、凋亡细胞数增加(P<0.05)。4)与CTL组比较，a HIOP组视网膜厚度减少(P<0.01)、凋亡细胞数增多(P<0.001)、fERG b波振幅降低(P<0.001)；与a HIOP组比较，aHIOP+Gen组视网膜厚度增加(P<0.05)、凋亡细胞数减少(P<0.05)、fERG b波振幅升高(P<0.05)；与aHIOP+Gen组比较，aHIOP+Gen+Apo组视网膜厚度减少(P<0.05)、凋亡细胞数增多(P<0.05)、fERG b波振幅降低(P<0.05)。结论：栀子苷通过Hspa1a-Akt通路抑制OGD/R及a HIOP诱导的视网膜细胞凋亡与组织损伤，为青光眼的中药治疗提供潜在靶点和新策略。

关键词

栀子苷 / 青光眼 / 视网膜神经节细胞 / 氧糖剥夺再灌注 / 细胞凋亡 / Hspa1a通路