肌萎缩侧索硬化相关FUS基因突变调控细胞应激反应的异质性

摘要

目的：肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种以运动神经元选择性死亡为核心特征的进行性神经退行性疾病，临床异质性显著且缺乏有效治疗手段，其病因与致病机制尚未完全阐明。融合性肉瘤（fused in sarcoma,FUS）基因作为ALS的关键致病基因之一，其编码蛋白质的致病突变主要分布于C端的核定位信号（nuclear localization signal,NLS）区域，而不同NLS突变位点在致病力、临床表型及分子机制上存在明显差异。本研究聚焦FUS蛋白NLS区域的2种典型致病突变(FUS^R514S和FUS^P525L)，探究其对细胞应激反应的调控差异并进行相关机制探索。方法：采用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在线工具对12个物种的FUS蛋白序列进行同源性比对，明确R514和P525位点的进化保守性。利用PyMOL软件对蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）中核转运蛋白与FUS蛋白复合物的三维结构（PDB ID:5YVG）进行分析，并通过PyMOL软件完成可视化展示。FUS突变体模型的构建采用PyMOL中的突变向导工具，通过选择目标构象异构体并执行突变流程实现。基于人胚肾细胞株（human embryonic kidney 293T,HEK293T）构建FUS基因野生型(FUS^WT)和突变型(FUS^R514S、FUS^P525L)Tet-on诱导表达细胞模型，分别采用蛋白质印迹法和免疫荧光法检测FUS蛋白的表达水平及亚细胞定位。采用洋地黄皂苷透化提取实验，结合十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）与蛋白质印迹法比较野生型和突变型FUS蛋白的聚集状态。采用蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（blue native PAGE,BN-PAGE）技术检测FUS蛋白突变对复合体稳定性的影响。采用流式细胞术测定线粒体膜电势及活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。利用亚砷酸钠诱导应激颗粒（stress granules,SGs）形成，并通过免疫荧光分析野生型和突变型FUS蛋白对SGs的影响。通过蛋白质印迹法检测线粒体功能相关蛋白[线粒体外膜转运酶20 kD亚基（translocase of outer membrane 20 kD subunit,Tom20）、电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1,VDAC1）等]及整合应激反应（integrated stress response,ISR）通路关键分子[磷酸化真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2 alpha,eIF2α）、激活转录因子4（activating transcription factor 4,ATF4）]的蛋白质表达水平变化。结果：序列比对分析显示R514和P525位点在12个物种的FUS蛋白中高度保守。三维结构的蛋白模型分析显示，FUS^R514S和FUS^P525L的突变破坏了FUS与核输入蛋白β2之间的氢键作用或疏水相互作用，削弱了二者结合的稳定性。蛋白质印迹法结果表明诱导表达野生型和突变型FUS蛋白的细胞模型建立成功，且外源性FUS蛋白表达对内源性FUS蛋白有轻微抑制作用。免疫荧光法结果显示野生型FUS蛋白主要定位于细胞核，而FUS^R514S和FUS^P525L突变型FUS蛋白均异常定位于细胞质，呈颗粒状分布。与野生型FUS蛋白相比，2种突变型FUS蛋白对线粒体膜电势、ROS水平及线粒体功能相关蛋白质的稳态水平均无显著影响（均P>0.05）。亚砷酸钠诱导后，突变型FUS蛋白形成SGs的速度比野生型快，形成的SGs直径更大，且突变型FUS蛋白在细胞中的分布和聚集状态与野生型不同（均P<0.05）。亚砷酸钠撤药后野生型与突变型FUS蛋白对SGs解聚影响的差异无统计学意义（P>0.05）。基础状态下，FUS^R514S突变型FUS蛋白的eIF2α磷酸化水平显著高于野生型，ATF4蛋白水平也呈升高趋势（均P<0.05）；而FUS^P525L突变型与野生型FUS蛋白之间的差异无统计学意义（P>0.05）。亚砷酸钠处理后各组e IF2α磷酸化水平均升高，但突变型间的差异消失。结论：FUS蛋白NLS序列的不同致病突变通过不同机制影响细胞应激反应，参与ALS的发生和发展，其中P525L可促进较大应激颗粒形成，R514S更易激活细胞ISR。

关键词

肌萎缩侧索硬化 / 融合性肉瘤基因 / 应激反应 / 应激颗粒 / 整合应激反应