LOX-1基因敲除改善小鼠代谢相关脂肪性肝炎（英文）

摘要

目的：代谢相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis,MASH）作为代谢相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease,MASLD）的进行性亚型，主要特征是肝脂肪变性、小叶内炎症和气球样变性，可进展至肝纤维化和肝硬化。凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1（lectin-like oxidized lowdensity lipoprotein receptor-1,LOX-1）是清道夫受体家族中的一员，能够识别和结合氧化型低密度脂蛋白。本研究旨在探究LOX-1在MASH进展中的作用。方法：通过基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库分析检测MASLD小鼠肝LOX-1的表达。免疫荧光染色检测肝纤维化患者肝组织LOX-1和α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）表达水平。采用CRISPR/胱天蛋白酶9（caspase-9,Cas9）技术构建LOX-1基因敲除(Lox-1^-/-)小鼠，取鼠尾组织进行基因型鉴定和分析。将野生型（wild type,WT）和Lox-1^-/-小鼠随机分为对照组和模型组，构建西方饮食模型，收集小鼠血清和肝组织，进行如下检测：采用生化检测试剂盒检测血清谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）水平；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色检测肝组织结构变化；Masson三色染色检测肝胶原纤维形成；油红O染色检测肝脂质沉积；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测肝纤维化标志基因表达。以人肝星状细胞系LX-2为模型，通过siRNA转染敲低LOX-1表达，采用RT-qPCR检测肝纤维化相关标志基因的表达水平，并利用免疫荧光染色观察LOX-1与α-SMA的共定位情况。通过网络药理学预测LOX-1调控MASH的关键靶点，利用检索基因/蛋白质相互作用的搜索工具（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins,STRING）数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络，并结合基因本体论（Gene Ontology,GO）富集分析筛选下游通路。结果：GEO数据库中的GSE30552、GSE40041数据集结果显示，高脂饮食（high fat diet,HFD）模型小鼠和胆管结扎（bile duct ligation,BDL）模型小鼠肝的Lox-1mRNA水平上调（均P<0.001）。肝纤维化患者肝组织LOX-1和α-SMA表达水平升高。Sanger测序和PCR鉴定结果显示LOX-1基因敲除小鼠构建成功。生化检测结果显示西方饮食模型WT小鼠的血清AST和ALT水平显著升高（均P<0.001）,LOX-1基因敲除后血清AST和ALT水平降低（均P<0.05）。HE染色结果显示，西方饮食模型喂养的WT小鼠肝可见明显的肝细胞气球样变性、脂肪变性、炎症细胞浸润及汇管区纤维增生，LOX-1基因敲除明显改善由西方饮食诱导的肝结构病变。Masson染色结果显示，与对照饲料喂养的小鼠肝组织相比，西方饮食饲料喂养的WT小鼠肝蓝色胶原纤维增多，LOX-1基因敲除抑制胶原纤维形成（均P<0.05）。RT-qPCR结果显示，西方饮食模型小鼠肝的Acta2、Col1a1和Timp1 mRNA水平显著升高，LOX-1基因敲除可降低肝纤维化标志基因表达水平。油红O染色结果显示西方饮食喂养的WT小鼠肝细胞明显增大，呈现大泡性脂肪变性，可见弥漫分布的红色脂滴，LOX-1基因敲除可改善肝脂质沉积（均P<0.001）。RT-qPCR结果显示敲低LOX-1可降低LX-2细胞Acta2、Col1a1和Timp1 mRNA水平（均P<0.05）。免疫荧光结果显示LX-2细胞LOX-1与α-SMA存在共定位，沉默LOX-1可抑制α-SMA表达。网络药理学结果提示LOX-1可能通过调节脂质代谢和胆固醇代谢网络促进MASH进展。结论：LOX-1基因敲除可改善西方饮食诱导的小鼠MASH，有望成为抗MASH治疗的新靶点。

关键词

凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1 / 西方饮食模型 / 代谢相关脂肪性肝炎 / 代谢相关脂肪性肝病 / 基因表达综合数据库