基于紫杉烷类治疗反应构建泛素化相关基因的乳腺癌预后模型

Construction of a ubiquitination-related gene prognostic model for breast cancer based on taxane treatment response

摘要

目的 紫杉烷类药物是乳腺癌一线化疗药物，其耐药常导致临床治疗失败。泛素化修饰在肿瘤进展及耐药中发挥关键调控作用。本研究旨在基于紫杉烷类药物的治疗反应，构建泛素化相关基因(ubiquitin-related genes，URGs)的乳腺癌预后模型，以预测患者对药物的敏感性与预后，挖掘潜在治疗靶点，为乳腺癌个体化治疗提供依据。 方法 从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库中获得接受紫杉烷类药物治疗的乳腺癌样本的相关信息，根据治疗反应将样本分为敏感组和耐药组，并作为训练集；采用基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库中的GSE25055数据集作为验证集。从泛素和泛素样缀合综合注释数据库(integrated Annotations for Ubiquitin and Ubiquitin-like Conjugation Database，iUUCD)中获得URGs全集后，筛选敏感组与耐药组差异表达的URGs。采用单因素Cox回归分析筛选与预后相关的差异表达基因，结合最小绝对收缩与选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)回归分析及10倍交叉验证法确定模型的核心基因并构建风险评分公式。根据风险评分将患者分为高风险组和低风险组，通过Kaplan-Meier生存分析、受试者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线评估模型的预后预测效能，整合风险评分与预后相关临床因素构建列线图并验证其准确性。此外，还基于癌症药物敏感性基因组学(Genomics of Drug Sensitivity in Cancer，GDSC)数据库及“pRRophetic”包分析高风险组与低风险组的药物敏感性差异，并计算药物半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC₅₀)。通过组织微阵列芯片分析和细胞实验对关键基因E4F1进行验证。 结果 筛选出59个敏感组与耐药组间差异表达的URGs，经单因素Cox和LASSO-Cox回归分析，确定E4F1、CBLL1、RNF13、TRIM59为核心基因并构建预后模型。在训练集(TCGA队列)中，预测1、3、5年总生存期(overall survival，OS)的曲线下面积(areas under the curve，AUC)分别为0.896(95% CI 0.754~1.000)、0.866(95% CI 0.723~1.000)和0.893(95% CI 0.768~1.000)；在独立验证集(GSE25055队列)中，相应的AUC分别为0.620(95% CI 0.467~0.685)、0.624(95% CI 0.508~0.692)和0.618(95% CI 0.497~0.719)，表明该模型能有效区分高风险组与低风险组患者。整合风险评分与TNM分期的列线图预测1、3、5年总生存期的AUC分别为0.992(95% CI 0.976~1.000)、0.890(95% CI 0.754~1.000)、0.897(95% CI 0.786~1.000)，校准曲线显示预测结果与实际生存情况吻合度较高。药物敏感性分析发现，高风险组与低风险组相比，有73种药物的IC₅₀存在显著差异，其中高风险组对Bryostatin-1、PHA-665752、Salubrinal的敏感性更高(均P<0.05)。高风险组患者与更高的T分期及更晚的综合临床分期均显著相关(均P<0.05)。实验结果发现，E4F1在乳腺癌细胞和组织中均显著高表达，且与患者较短的OS显著相关(均P<0.05)。敲减E4F1的表达能有效抑制乳腺癌细胞的侵袭与迁移，且与紫杉醇联用后该抑制作用被进一步增强(均P<0.05)。 结论 由E4F1、CBLL1、RNF13、TRIM59构建的预后模型是预测乳腺癌患者预后和药物敏感性的有效工具，有助于指导乳腺癌患者的个体化治疗。其中，E4F1为潜在的致癌基因，可能是增强紫杉醇敏感性的干预靶点。

Abstract

Objective Taxanes are first-line cchemotherapeutic agents for breast cancer; however, the development of resistance often leads to treatment failure. Ubiquitination plays a critical regulatory role in tumor progression and drug resistance. This study aims to construct a prognostic model based on ubiquitination-related genes (URGs) according to taxane treatment response, to predict patient prognosis and drug sensitivity, identify potential therapeutic targets, and provide a basis for individualized treatment of breast cancer. Methods Breast cancer samples treated with taxanes were obtained from The Cancer Genome Atlas (TCGA) and classified into taxane-sensitive and taxane-resistant groups as the training cohort. The GSE25055 dataset from the Gene Expression Omnibus (GEO) was used as the validation cohort. A comprehensive list of URGs was retrieved from the Integrated Annotations for Ubiquitin and Ubiquitin-like Conjugation Database (iUUCD), and differentially expressed URGs between sensitive and resistant groups were identified. Univariate Cox regression analysis was performed to screen prognostic genes, followed by least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) Cox regression with 10-fold cross-validation to identify core genes and construct a risk score model. Patients were stratified into high- and low-risk groups based on the risk score. Kaplan-Meier survival analysis and receiver operating characteristic (ROC) curves were used to evaluate predictive performance. A nomogram integrating risk score and clinical factors was developed and validated. Drug sensitivity differences between risk groups were analyzed using the Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) and the pRRophetic R package, with estimation of half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀). Tissue microarray analysis and cellular experiments were conducted to validate the key gene E4F1. Results A total of 59 differentially expressed URGs were identified between taxane-sensitive and resistant groups. Through univariate Cox and LASSO-Cox analyses, 4 core genes (E4F1, CBLL1, RNF13, and TRIM59) were selected to construct the prognostic model. In the training cohort (TCGA), the areas under the ROC curve (AUCs) for predicting 1-, 3-, and 5-year overall survival (OS) were 0.896 (95% CI 0.754 to 1.000), 0.866 (95% CI 0.723 to 1.000), and 0.893 (95% CI 0.768 to 1.000), respectively. In the validation cohort (GSE25055), the corresponding AUCs were 0.620 (95% CI 0.467 to 0.685), 0.624 (95% CI 0.508 to 0.692), and 0.618 (95% CI 0.497 to 0.719), indicating that the model could effectively distinguish high- and low-risk patients. The nomogram integrating risk score and TNM stage showed improved predictive performance, with AUCs of 0.992 (95% CI 0.976 to 1.000), 0.890 (95% CI 0.754 to 1.000), and 0.897 (95% CI 0.786 to 1.000) for 1-, 3-, and 5-year OS, respectively, and good calibration. Drug sensitivity analysis identified 73 agents with significant IC₅₀ differences between the two groups. The high-risk group exhibited increased sensitivity to Bryostatin-1, PHA-665752, and Salubrinal (all P<0.05). High-risk patients were significantly associated with both higher T stage and more advanced overall clinical stage (both P<0.05). Experimental validation demonstrated that E4F1 was significantly overexpressed in breast cancer cells and tissues, and correlated with shorter OS (all P<0.05). Knockdown of E4F1 significantly inhibited invasion and migration of breast cancer cells, and this inhibitory effect was further enhanced when combined with paclitaxel (all P<0.05). Conclusion The prognostic model based on E4F1, CBLL1, RNF13, and TRIM59 is an effective tool for predicting prognosis and drug sensitivity in breast cancer patients and may facilitate individualized treatment strategies. Among these, E4F1 may function as a potential oncogene and serve as a therapeutic target for enhancing taxane sensitivit.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / 泛素化 / 泛素化相关基因 / 紫杉烷 / 耐药 / 药物敏感性 / 预后预测模型

Key words

breast cancer / ubiquitination / ubiquitination-related genes / taxanes / drug resistance / drug sensitivity / prognostic model

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤^[1]。2020年中国女性新发乳腺癌病例超41.6万例，相关死亡人数超过11.7万^[2]。尽管针对乳腺癌已研发出多种治疗方法，包括靶向药物治疗和免疫治疗等，但紫杉烷类药物(包括紫杉醇、多西他赛)仍是乳腺癌一线的化疗方案^[3]。然而，其耐药性的产生常导致治疗失败和肿瘤快速复发^[4]。因此，筛选与紫杉烷类药物耐药性相关的差异表达基因十分必要。此外，分析这些差异表达基因对预后和药物敏感性的影响，对于寻找逆转耐药性的新靶点以及改善预后均具有重要意义。

泛素化相关基因(ubiquitin-related genes，URGs)通过调控蛋白质周转，在细胞周期进程、细胞发育、DNA转录、细胞内运输及凋亡等生物学过程中发挥重要作用^[5]。泛素化与去泛素化平衡的破坏与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关^[6]。有研究^[7]报道，在多西他赛耐药的前列腺癌细胞中，蛋白质泛素化是差异最显著的调控通路。已有研究^[8-9]表明，FBXW2与USP7均参与调控乳腺癌对紫杉醇的敏感性。这提示泛素化修饰在乳腺癌对紫杉烷类药物的耐药中扮演着重要角色，URGs可作为重要的生物标志物和治疗靶点。尽管已有2项研究^[10-11]报道了URGs在乳腺癌预后模型中的作用，但与紫杉烷类药物耐药相关的差异表达的URGs在预测乳腺癌患者预后、药物敏感性及临床病理特征方面的作用，仍有待进一步研究。

因此，本研究基于紫杉烷类药物的治疗反应，筛选相关的差异表达的URGs，构建并验证乳腺癌预后模型，旨在为临床预后评估提供新的分子工具，也为探索增强紫杉烷类药物敏感性的新靶点和个体化治疗策略提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料

从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库^[12]下载133例使用紫杉烷类药物治疗且有预后信息的乳腺癌样本的转录组数据及临床资料。将样本按照治疗反应分组，其中敏感、完全应答、部分应答为敏感组，临床进展性疾病、疾病稳定为耐药组。敏感组纳入119例样本，耐药组纳入14例样本，该数据集作为训练集。从基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库下载数据集GSE25055作为验证集，其中包含310个肿瘤样本^[13-14]。从泛素和泛素样缀合综合注释数据库(integrated Annotations for Ubiquitin and Ubiquitin-like Conjugation Database，iUUCD)^[15]获得1 357个泛素及类泛素修饰调控因子，包括E1泛素激活酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶、去泛素化酶、泛素/类泛素结合域蛋白及类泛素结构域蛋白。本研究将上述调控因子定义为URGs。将iUUCD中的1 357个URGs与TCGA中的19 938个基因取交集，最终得到1 318个URGs。

1.2 差异表达URGs的筛选

基于已获得的1 318个URGs，利用limma包(Version 3.52.4)分析训练集中紫杉烷类药物敏感组与耐药组间的差异表达的URGs，计算差异倍数(fold change，FC)，将P<0.05且|log₂FC|>0.263的基因定义为显著差异表达的URGs^[16]，用于后续分析。

1.3 URGs预后模型的构建与验证

首先，采用survival R包(Version 2.41-1)对筛选得到的显著差异表达基因进行单因素Cox回归分析，筛选出与预后相关的URGs。随后，通过Glmnet包(Version 4.1-6)的最小绝对收缩与选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)-Cox回归分析和10倍交叉验证，选择λ.min以确定最终模型的关键基因及系数。本研究选择λ.min而非λ.1se作为最终模型的惩罚参数，是由于λ.min对应于10倍交叉验证中平均误差最小的点，能够确保模型在训练集数据中达到最佳的拟合效果，从而更充分地识别潜在相关的生物标志物。鉴于本研究中耐药组的样本量相对有限，选择λ.min可避免剔除潜在的有效预测变量。基于所选基因的表达水平及其回归系数，建立风险评分公式：风险评分=exp(∑βᵢXᵢ)。公式中βi为各基因的LASSO回归系数，Xi为对应基因的表达水平。根据风险评分公式计算出每个样本的分数，风险评分高于中位数值的样本划为高风险组，风险评分等于或低于中位数值的样本划为低风险组，并利用R软件(Version 3.6.1)绘制患者风险评分的分布图及生存状态图。采用R软件的survival包绘制Kaplan-Meier曲线，评估高、低风险组的总生存期(overall survival，OS)，并绘制时间依赖性受试者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，计算1、3及5年生存预测的曲线下面积(area under the curve，AUC)以评价该特征的预测效能。

1.4 列线图模型的构建与评估

利用R软件的survival包对样本的临床因素(包括年龄、种族、TNM分期)和风险评分进行单因素Cox回归分析和多因素Cox回归分析，以筛选独立的预后因素。基于上述筛选的独立预后因素，采用R软件中的rms包(Version 5.1-2)构建列线图。采用R软件的survival包绘制Kaplan-Meier曲线，评估高低风险组的OS差异；绘制时间依赖性ROC曲线，计算1、3及5年生存预测的AUC，并绘制列线图生存率校准曲线，以评价该特征的预测效能。

1.5 药物敏感性预测与临床相关性分析

通过癌症药物敏感性基因组学(Genomics of Drug Sensitivity in Cancer，GDSC)数据库，评估高、低风险组对138种药物的敏感性。采用“pRRophetic”R软件包(Version 0.5)计算药物半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC₅₀)。若高风险组IC₅₀低于低风险组，提示高风险组对这些药物的敏感性更高。若高风险组IC₅₀高于低风险组，则提示高风险组对这些药物的敏感性更低。整合TCGA中乳腺癌样本的临床信息数据，分析风险评分在不同临床特征(如紫杉烷类药物敏感性、TNM分期等)条件下的分布差异。

1.6 组织微阵列芯片分析

采用上海芯超生物科技有限公司提供的乳腺癌组织微阵列芯片(产品编号TFBrec-01、TFBrec-02)。免疫组织化学染色采用美国Sigma Aldrich公司的E4F转录因子1(E4F transcription factor 1，E4F1)一抗(货号HPA072309，稀释比1꞉500)。免疫组织化学染色的具体操作如下。将乳腺癌组织芯片放入烘箱中，温度调至63 ℃，烘蜡1 h。然后在全自动染色机(德国Leica公司，型号LEICAST5020)中完成脱蜡。脱蜡时间如下：1)二甲苯2缸，每缸浸泡15 min；2)100%乙醇2缸，每缸浸泡7 min；3)90%乙醇1缸，浸泡5 min；4)80%乙醇1缸，浸泡5 min；5)70%乙醇1缸，浸泡5 min。根据“PTLink简明操作规程”，将玻片进行抗原修复，修复完毕后，浸入室温的蒸馏水中，使其自然冷却10 min以上。随后用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline with Tween-20，PBST)冲洗；加入稀释好的E4F1一抗工作液，于4 ℃冰箱中过夜孵育。次日从冰箱取出玻片，室温下复温45 min，PBST清洗。将玻片放入Dako全自动免疫组织化学染色系统(丹麦Dako公司，型号Autostainer Link 48)，使用免疫显色剂(丹麦Dako公司，货号K8002)，按照“Autostainer Link 48使用指南”选择相应程序运行。在室温下孵育20 min，使E4F1一抗与即用型过氧化物酶葡聚糖聚合物和羊抗兔二抗结合，并采用3,3’-二氨基联苯胺(3,3’- diaminobenzidine，DAB)进行显色。用苏木精(中国香港基因有限公司，货号GT100540)染色1 min后，在0.25%的盐酸乙醇(400 mL 70%乙醇+1 mL浓盐酸)中浸没5 s，用自来水冲洗3 min。室温下晾干玻片，用中性树脂封片。最后使用Aperio扫描仪(德国Leica公司，型号Aperio XT)扫描制备的玻片得到可分析的图片。采集数据时严格执行双盲原则以确保客观性。阳性细胞比例评分标准为：0分(无阳性细胞)、1分(阳性细胞比例≤25%)、2分(阳性细胞比例为26%~50%)、3分(阳性细胞比例为51%~75%)、4分(阳性细胞比例>75%)。染色强度分级标准为：0分(无色)、1分(淡棕)、2分(棕)、3分(深棕)。每个样本随机选取3个独立视野，单个视野的染色指数=阳性细胞比例分值×染色强度分值，最终取3个独立视野的均值作为该样本的染色指数，并分析其与OS、无病生存期(disease-free survival，DFS)的关系。

1.7 细胞培养

本研究所用非致瘤乳腺上皮细胞MCF-10A(货号CRL-10317)，以及乳腺癌细胞系SK-BR-3(货号HTB-30)、MCF-7(货号HTB-22)、BT-474(货号HTB-20)、BT-549(货号HTB-122)和MDA-MB-231(货号HTB-26)均购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。其中，非致瘤性乳腺细胞MCF-10A采用杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)-F12(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号11320033)，加入0.5 μg/mL氢化可的松(美国MedChemExpress公司，货号HY-N0583)、10 μg/mL胰岛素(美国Sigma Aldrich公司，货号I2643)、20 ng/mL人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)(美国Sigma Aldrich公司，货号E5036)及10%胎牛血清(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号10091148)。SK-BR-3、MCF-7、BT-549和MDA-MB-231细胞使用DMEM(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号11965092)培养，加入10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号15070063)。BT-474细胞采用RPMI 1640培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号11875093)并添加等量的血清及1%青霉素-链霉素。所有细胞均在37 ℃、含5% CO₂的恒温培养箱中常规培养。

1.8 蛋白质印迹法

细胞经预冷磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)漂洗后，采用RIPA裂解液(上海碧云天生物技术股份有限公司，货号P0013B)进行裂解，收集细胞，超声破碎细胞后(参数设置为振幅30%，超声3 s，间歇10 s，重复5个循环)，冰上静置10 min，于4 ℃下以12 000 g离心30 min，取上清液，即为蛋白质样本。对所获得的蛋白质样品采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)进行分离后，转印至0.45 μm聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜(德国Merck Millipore公司)。转印膜经5%脱脂奶粉封闭后，于4 ℃下分别与E4F1一抗(稀释比1꞉1 000)和内参蛋白质β-微管蛋白(β-tubulin)一抗(美国Cell Signaling Technology公司，货号15115；稀释比1꞉10 000)孵育过夜。继而采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔二抗(美国Jackson ImmunoResearch公司，货号111-035-003；稀释比1꞉10 000)室温下孵育2 h。最后采用化学发光HRP底物试剂盒(德国Merck Millipore公司，货号WBULP-100ML)对所标记的蛋白质进行显色，使用ImageQuant LAS 4000^TM成像系统(美国GE HealthCare Technologies公司)进行信号采集。

1.9 细胞转染

采用干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)转染MDA-MB-231细胞以敲减E4F1基因的表达，用蛋白质印迹法验证敲减效果。siRNA转染步骤如下：细胞接种至适宜密度(30%~50%融合度)后，采用Lipofectamine^TM 3000转染试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号L3000015)分别转染阴性对照siRNA即si-NC(广州锐博生物技术有限公司，货号siN0000001-1-5)及靶向E4F1的siRNA即si-E4F1(广州锐博生物技术有限公司，货号stB0006201A-C)。转染操作严格遵循说明书，转染后继续培养48 h。si-E4F1的序列设计见表1。

1.10 侵袭与迁移试验

迁移试验使用未包被Matrigel的裸膜小室(德国Merck Millipore公司，货号PTMP24H48)，侵袭试验采用Matrigel包被小室(美国Corning公司，货号CB-40234C)。si-E4F1或si-NC转染细胞48 h后，胰酶消化后收集细胞，重悬于含紫杉醇(美国MedChemExpress公司，货号HY-B0015)的无血清培养基中，以2×10⁴个细胞/孔的密度接种至小室上腔。参考乳腺癌MDA-MB-231细胞体外功能的相关报道^[17-18]，紫杉醇浓度设定为1 μmol/L。下腔加入含血清完全培养基，该培养基由无血清培养基与胎牛血清(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号11965092)以体积比9꞉1配置而成。孵育24 h后，迁移/侵袭至膜下表面的细胞经4%多聚甲醛固定液(上海碧云天生物技术股份有限公司，货号P0099)固定、0.1%结晶紫(上海碧云天生物技术股份有限公司，货号Y268091-100 g)染色，于奥林巴斯IX71倒置显微镜下进行计数和分析。

1.11 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示。小样本(n<50)的正态性检验采用Shapiro Wilk检验，大样本(n≥50)则采用Kolmogorov-Smirnov检验。符合正态分布且方差齐性的2组间比较采用双尾Student t检验，多组间比较采用单因素方差分析。不符合正态分布的2组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 差异基因筛选与预后模型构建

通过单因素Cox回归分析鉴定出17个与预后相关的URGs(表2)。TCGA中敏感组与耐药组的差异表达基因聚类热图如图1A所示，在与iUUCD取交集得到的1 318个URGs中，进一步筛选得到敏感组和耐药组差异表达的URGs 59个，其中48个表达上调，11个表达下调(均P<0.05，图1B)。采用LASSO回归分析，通过10倍交叉验证，筛选出4个关键基因(CBLL1、RNF13、TRIM59、E4F1)并计算对应的回归系数(-1.194、-0.777、-0.826、0.040)。根据这4个关键基因的回归系数计算预后风险评分，即E4F1×0.040+CBLL1×(-1.194)+RNF13×(-0.777)+TRIM59×(-0.826)，并通过10倍交叉验证确定了LASSO模型的λ参数及17个URGs的LASSO回归系数(图1C、1D)。

2.2 预后模型在训练集与验证集中的效能

风险评分分布及乳腺癌患者生存状态分析结果(图2)表明，低风险组患者的OS显著优于高风险组(均P<0.05)。训练集中预测1、3、5年OS的AUC值分别为0.896(95% CI 0.754~1.000)、0.866(95% CI 0.723~1.000)、0.893(95% CI 0.768~1.000)，验证集中分别为0.620(95% CI 0.467~0.685)、0.624(95% CI 0.508~0.692)、0.618(95% CI 0.497~0.719)，表明该模型具有良好的预测准确性。

2.3 列线图模型的构建与评估

单因素及多因素Cox回归分析结果(表3)显示，风险评分和TNM分期均与患者预后显著相关(均P<0.05)。为了更精准预测乳腺癌患者的预后，本研究进一步整合风险评分与TNM分期构建了预后列线图模型(图3A)。Kaplan-Meier曲线结果(图3B、3C)显示，低风险组患者的生存概率显著更高(P<0.01)；该模型预测1、3、5年OS的AUC值分别为0.992(95% CI 0.976~1.000)、0.890(95% CI 0.754~1.000)、0.897(95% CI 0.786~1.000)。校准曲线(图3D~3F)显示，列线图预测的OS与实际OS高度吻合，提示该模型的预测准确性较好。

2.4 药物敏感性及其与临床特征的相关性分析

138种药物的敏感性分析结果(表4，图4A~4C)显示，73种药物在高、低风险组中的IC₅₀有差异。其中差异最显著的前3种药物是Bryostatin-1、PHA-665752和Salubrinal(均P<0.001)，这3个药物在高风险组的IC₅₀均低于低风险组，即高风险组对这3个药物敏感性更高，提示该预后模型不仅能评估生存风险，还可以有效区分患者对不同药物的敏感性。

风险评分在不同临床特征之间的分布分析结果(图4D~4F)显示，耐药组患者的风险评分显著高于敏感组患者；TNM III期患者的风险评分较I~II期患者显著升高；病理T3分期患者的风险评分明显高于T1及T2分期患者(均P<0.05)。这些结果表明风险评分与药物敏感性及肿瘤进展程度均显著相关。

2.5 组织芯片验证E4F1与乳腺癌预后的关系

乳腺癌及癌旁组织中E4F1的组织微阵列表达分析结果(图5A、5B)显示，乳腺癌组织中E4F1的蛋白质表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线分析结果(图5C、5D)表明，E4F1高表达与患者较短的OS显著相关(P<0.05)，也与患者较短的DFS相关，但差异无统计学意义(P>0.05)。单因素Cox回归分析结果表明，OS与E4F1表达水平、肿瘤大小、N分期、M分期及TNM分期均显著相关；多因素Cox回归分析进一步证实E4F1表达水平、M分期及TNM分期均是乳腺癌患者预后的独立预测因子(均P<0.05，表5)。

2.6 细胞水平验证E4F1在乳腺癌中的功能

乳腺癌细胞系(SK-BR-3、MCF-7、BT-474、BT-549、MDA-MB-231)及非致瘤乳腺上皮细胞(MCF-10A)的E4F1蛋白质表达水平分析结果(图6A)显示，SK-BR-3、BT-549、MDA-MB-231细胞的E4F1表达水平较MCF-10A均显著上调(均P<0.05)。利用siRNA敲减MDA-MB-231细胞中E4F1的表达水平，结果(图6B)显示，si-E4F1 1#、si-E4F1 2#及si-E4F1 3#均能显著降低MDA-MB-231细胞中E4F1蛋白的表达水平(均P<0.05)。Transwell实验(图6C、6D)表明，敲减E4F1可显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移与侵袭能力，且与紫杉醇联用后该抑制作用被进一步增强(均P<0.05)。

3 讨 论

本研究基于紫杉烷类治疗反应，筛选差异表达的URGs，成功构建了包含E4F1、CBLL1、RNF13和TRIM59的预后模型，且整合构建的风险评分与TNM分期列线图提升了预测效能。该模型在训练集和独立验证集中均能有效区分乳腺癌高、低风险患者，与临床病理特征显著相关，同时可预测药物敏感性，为个体化诊疗提供了辅助工具。本研究进一步通过组织芯片、体外功能实验证实了E4F1为潜在的致癌基因，并可能作为增强紫杉醇药物敏感性的干预靶点。本研究首次发现泛素化修饰、紫杉烷类耐药与乳腺癌预后的关联，多维度验证了关键基因的功能，填补了紫杉烷类药物耐药相关URGs在乳腺癌预后及药物敏感性预测领域的研究空白。

本研究筛选的4个差异表达的预测基因均在乳腺癌发生与发展中扮演关键角色^[19-24]，这从生物学功能层面上佐证了本研究所构建模型的可靠性。其中，本研究首次通过大样本组织芯片和体/内外功能实验，多维度验证了E4F1在乳腺癌中的致癌作用。这一发现与Batnini等^[19]在三阴性乳腺癌中的研究结论一致，其结果表明，降低E4F1表达水平可抑制毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ataxia telangiectasia-mutated kinase，ATM)-毛细血管扩张性共济失调突变基因Rad3相关蛋白(ataxia telangiectasia-mutated gene and Rad3-related kinase，ATR)-检查点激酶1(​checkpoint kinase 1，CHK1)信号通路，进而增强乳腺癌对化疗药物的敏感性。E4F1作为重要的转录因子，其下游调控的靶基因网络将是未来研究的重点。本研究筛选的其余3个基因在乳腺癌中的功能也已得到部分验证。TRIM59在不同类型肿瘤中表现出致癌或抑癌的双重功能^[20]。Liu等^[21]的研究结果表明，TRIM59在乳腺癌组织中高表达，且与患者不良预后密切相关，可显著促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移及对紫杉醇的耐药；其具体机制包括上调周期蛋白(cyclin)A、cyclin E、B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma，Bcl)-xl、Bcl-2及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-AKT)的表达，同时下调p21、p27、p53的表达，此外还可促进p53的泛素化。由此可见，TRIM59在乳腺癌中可通过调控多条关键信号通路及蛋白质的泛素化修饰，发挥重要的促癌作用。CBLL1是一种E3泛素连接酶，可介导E‑钙黏着蛋白的泛素化修饰，进而破坏细胞间的黏附连接，提升细胞迁移能力^[22]。同时，CBLL1高表达与乳腺癌患者更好的预后相关，且可通过参与调控凋亡、雌激素受体(estrogen receptor，ER)1-ERα通路、免疫应答^[23]，在乳腺癌中发挥重要生物学功能。RNF13在胰腺癌中高表达，并通过RING结构域依赖的泛素化修饰，上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9，促进胰腺癌细胞侵袭与肿瘤进展^[24]。但是该基因在乳腺癌中的作用仍缺乏相关研究支持，有待进一步探索。综上所述，本研究筛选的4个预测基因均与肿瘤恶性进展密切相关，且功能机制各有侧重，为后续深入解析其在乳腺癌中的作用及临床转化研究提供了重要的理论依据。

E4F1、CBLL1、RNF13和TRIM59均是泛素化途径中的重要成员，且均在肿瘤中发挥调控作用，但目前尚未发现它们之间存在统一、直接的调控网络。尽管如此，基于现有研究推测，它们在泛素化系统中可能存在间接关联。首先，E4F1和TRIM59均为p53的调控因子。E4F1可通过调控非典型的E3泛素连接酶的活性调节p53的染色质定位和功能^[25]。TRIM59的过表达可显著促进p53的泛素化，导致p53蛋白表达水平下降^[21]。其次，RNF13与TRIM59均参与调控自噬相关通路。RNF13在饥饿或碱性条件下被激活，介导小鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)酶ARL8B的泛素化降解，驱动溶酶体向近核处聚集，进而促进自噬体‑溶酶体融合^[26]。TRIM59则通过抑制核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路降低BECN1转录水平，同时干扰肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)6介导的beclin 1的K63链泛素化，整体上发挥抑制自噬启动的作用^[27]。这些基因在多种疾病模型中展现出复杂多样的生物学功能，其在肿瘤中的具体作用机制及调控网络，将为包括乳腺癌在内的肿瘤防治研究提供重要理论依据与新思路。

本研究的敏感性分析结果显示，高风险组与低风险组在73种药物的IC₅₀值上存在显著差异。其中，Bryostatin-1、PHA-665752、Salubrinal的组间差异最显著，且高风险组中这3种药物的IC₅₀更低，提示其敏感性更高。该结果不仅拓展了预后模型的临床价值，更为不同风险分层患者的个体化用药提供了参考。Bryostatin-1是一种海洋来源的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)调节剂。研究^[28]证实其可特异性结合并调节PKC同工酶，从而改变细胞信号转导通路，抑制乳腺癌细胞增殖。高风险组对Bryostatin-1敏感性更高，提示这些患者的肿瘤细胞可能高度依赖PKC信号通路以维持增殖和存活。PHA-665752是一种高度选择性的细胞间质上皮转换因子(cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met)-腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)竞争性抑制剂。在包括乳腺癌细胞在内的多种细胞系中，其可抑制c-Met驱动的细胞生长、运动和侵袭^[29]。另有研究^[30]发现，PHA‑665752可通过抑制c‑Met及其下游Src/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)/髓样细胞白血病1(myeloid cell leukemia 1，Mcl‑1)/低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)‑1α信号轴，对高表达c‑Met的口腔鳞癌细胞有明显的抗增殖、促凋亡和抗血管生成作用。高风险组对其敏感性更高，提示肿瘤细胞的恶性生物学行为维持可能高度依赖c-Met的活性。Salubrinal选择性抑制真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)2α的去磷酸化，从而维持内质网应激中未折叠蛋白质应答(unfolded protein response，UPR)通路的激活。肿瘤细胞常通过UPR通路适应缺氧、营养匮乏等环境压力。而Salubrinal通过上调eIF2α磷酸化水平，逆转MCF-7细胞对多柔比星耐药的表型并增强该药的促凋亡效应^[31]。高风险组对Salubrinal更敏感，提示其可能更依赖UPR通路生存，利用Salubrinal可能逆转其对传统治疗药物的耐药性。这些药物敏感性的差异提示，高风险患者可能依赖于特定的代谢通路(如PKC、c-Met或UPR通路)。针对这些通路的精准药物筛选和个体化联合治疗方案，可能为临床治疗提供新的方向。

本研究的价值不仅在于乳腺癌的预测，更在于潜在的治疗指导。首先，该模型与列线图整合后，能提供量化、个体化的生存概率预测，有助于临床医师对高危患者进行更密切的随访或实施更积极的辅助治疗。其次，药物敏感性分析揭示了高、低风险组对不同化疗药物的敏感性，提示该模型或可用于指导化疗方案的选择。此外，随着液体活检技术的成熟，外周血循环中的URGs(如E4F1)有望作为无创生物标志物，实现对乳腺癌患者治疗反应的实时动态监测。这种基于血液的动态监测手段不仅能够克服组织活检的侵入性限制，还能捕捉肿瘤进展过程中的微小变化，为临床提供更及时的用药决策依据。最后，E4F1的功能验证实验表明，靶向E4F1不仅能抑制肿瘤的侵袭迁移，还能增强紫杉烷类药物的毒性，这使其成为一个具有潜力的治疗靶点。

本研究虽基于紫杉烷类药物的治疗反应成功构建了URGs乳腺癌预后模型并完成了多维度的验证，但仍存在一些局限性。其一，训练集中耐药组样本量仅14例，远少于敏感组的119例，这是由于TCGA数据库中同时具备明确紫杉烷类药物治疗反应、转录组与预后信息的样本稀缺。本研究已通过LASSO-Cox回归配合10倍交叉验证进行基因特征的筛选，综合运用AUC、校准曲线、决策曲线分析等多种指标对模型的效能进行多角度评估，但样本不平衡仍可能对模型的稳定性和泛化能力产生一定影响。后续将整合公共数据库中更多具有紫杉烷类药物治疗信息的独立乳腺癌队列，并联合多中心开展回顾性或前瞻性临床研究，以扩大耐药病例的样本量，进一步系统性评估本研究所建模型的稳健性。不过，本模型在现有数据条件下仍表现出稳定的风险分层能力与临床适用性，可为后续大规模队列研究提供依据。其二，本研究仅采用GSE25055这一个独立的GEO数据集进行外部验证，虽为该研究领域常见做法，但验证维度相对单一，模型的泛化能力仍需更多独立队列进一步佐证。其三，构建列线图时，因纳入完整临床变量需保留信息完整的样本，导致训练样本量减少，1年随访终点事件数仅2例，造成短期预测的AUC虚高，且中远期随访中删失样本较多，使3年、5年AUC的95% CI较宽，影响区间估计的稳定性。因此，该模型仍需在更大样本量、更低删失率的外部队列中进一步验证和优化，以提升其稳定性与临床实用性。其四，模型包含的4个核心基因中，除E4F1完成组织芯片与体外功能实验验证外，CBLL1、RNF13、TRIM59在乳腺癌中的功能研究相对不足，其在乳腺癌进展及紫杉烷类药物耐药中的具体生物学功能、分子机制尚未开展实验验证。

综上所述，本研究基于紫杉烷类药物的治疗反应，构建了由E4F1、CBLL1、RNF13、TRIM59组成的乳腺癌预后模型。该模型经TCGA训练集与GSE25055验证集验证，可有效区分高、低风险患者，预测预后及药物敏感性，为个体化治疗提供了工具。本研究发现E4F1在乳腺癌中高表达且与不良预后相关，敲减其表达水平可抑制癌细胞的侵袭和迁移，联用紫杉醇时效果更显著。E4F1是潜在的致癌基因，并可能作为增强紫杉醇敏感性的干预靶点。

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基金资助

佛山市自筹经费类科技创新项目(2320001006317)

广东医科大学附属佛山市妇幼保健院妇女儿童医学研究中心院内科研资助项目(FEYJZX-2020-005┫。This work was supported by the Foshan Self-financed Science and Technology Innovation Project ┣2320001006317)

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