穿刺组织浸洗液在非小细胞肺癌的EGFR基因突变检测中的应用

Application of puncture tissue rinse solution in the detection of EGFR gene mutations in non-small cell lung cancer

摘要

目的 非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的精准靶向治疗需要基于基因突变的分子分型，尤其是包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在内的驱动基因突变的检测，对于晚期和转移性NSCLC患者的治疗决策至关重要。目前临床核酸获取来源包括肿瘤组织石蜡标本、胸腔积液离心后的细胞学标本、血液、胸腔积液上清等体液中的游离DNA。本研究旨在采用肺穿刺活检组织的双蒸水浸洗液提取的核酸进行基因突变检测，验证该核酸来源的可行性，并分析其检测结果与基于穿刺活检组织的二代测序(next-generation sequencing，NGS)检测结果的一致性，为后续的病理诊断与治疗提供依据。 方法 纳入中南大学湘雅二医院肿瘤科收治的临床诊断为NSCLC的女性患者，在CT引导下经皮肺穿刺活检，活检组织通过石蜡包埋制作切片进行NGS检测；同时提取活检组织双蒸水浸洗液中的DNA，采用超扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(super amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction，Super-ARMS)法进行EGFR基因突变检测，DNA剩余量符合质控标准的组织标本进一步行NGS基因检测。比较穿刺活检组织双蒸水浸洗液的基因检测结果与相应石蜡切片标本的NGS基因检测结果的一致性。此外，分别测定经皮肺穿刺活检标本及穿刺针浸洗液的DNA含量，比较二者的差异。 结果 对于29例NSCLC患者，穿刺活检组织双蒸水浸洗液Super-ARMS法检测出EGFR基因突变阳性19例、阴性10例，组织石蜡样本NGS法检测出EGFR基因突变阳性20例、阴性9例。穿刺活检组织双蒸水浸洗液Super-ARMS法对比组织石蜡样本NGS法的敏感度为95%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为90%，准确率为96.5%。6例穿刺活检组织双蒸水浸洗液经Super-ARMS法后的DNA符合质控标准，行NGS基因检测的结果显示EGFR基因突变阳性3例、阴性3例，与Super-ARMS法完全一致，与组织石蜡样本NGS检测结果相符。穿刺活检组织双蒸水浸洗液Super-ARMS法的EGFR基因检测需1~2 d，NGS检测需7 d，组织石蜡样本NGS检测需14~15 d。3例NSCLC穿刺组织双蒸水浸洗液与穿刺针浸洗液的DNA含量配对比较结果显示，组织浸洗液DNA含量高于穿刺针浸洗液DNA含量。 结论 CT引导下经皮肺穿刺活检标本的双蒸水浸洗液提取的DNA，可作为快速高效获得NSCLC基因分型的核酸标本来源，尽早为临床诊疗提供依据。

Abstract

Objective Precision targeted therapy for non-small cell lung cancer (NSCLC) relies on molecular classification based on gene mutations. Detection of driver gene mutations, particularly epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations, is crucial for treatment decision-making in locally advanced and metastatic NSCLC. Currently, clinical sources of nucleic acids include formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tumor tissues, cytological specimens from centrifuged pleural effusion, blood, and circulating free DNA in body fluids such as pleural effusion supernatant. This study aims to extract nucleic acids from the double-distilled water rinse solution of lung biopsy specimens for gene mutation detection, to evaluate the feasibility of this nucleic acid source, and to analyze the concordance between its detection results and those obtained from tissue-based next-generation sequencing (NGS), thereby providing a basis for subsequent pathological diagnosis and treatment. Methods Female patients clinically diagnosed with NSCLC and admitted to the Department of Oncology, the Second Xiangya Hospital of Central South University were included. CT-guided percutaneous lung biopsy was performed. Biopsy tissues were processed into paraffin-embedded sections for NGS testing. Meanwhile, DNA was extracted from the double-distilled water rinse solution of biopsy tissues, and EGFR gene mutations were detected using the super amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction (Super-ARMS). Samples with remaining DNA meeting quality control standards were further subjected to NGS. The concordance between gene mutation results from the rinse solution and those from corresponding FFPE tissue samples was analyzed. In addition, DNA concentrations from percutaneous biopsy specimens and from the rinse solution of the puncture needle were measured and compared. Results Among 29 NSCLC patients, Super-ARMS of the biopsy tissue rinse solution detected 19 EGFR mutation-positive cases and 10 negative cases, while NGS of FFPE tissue samples detected 20 positive cases and 9 negative cases. Compared with tissue NGS, the rinse solution Super-ARMS showed a sensitivity of 95%, specificity of 100%, positive predictive value of 100%, negative predictive value of 90%, and an overall accuracy of 96.5%. In 6 cases, DNA from the rinse solution met quality control standards after Super-ARMS and was further analyzed by NGS, showing 3 EGFR mutation-positive and 3 negative cases. These results were completely consistent with those obtained by Super-ARMS and were concordant with tissue-based NGS results. The turnaround time for EGFR mutation detection using rinse solution Super-ARMS was 1-2 days, compared with 7 days for NGS using rinse solution DNA and 14-15 days for NGS using FFPE tissue samples. In 3 paired NSCLC samples, the DNA concentration of tissue rinse solution was higher than that of the puncture needle rinse solution. Conclusion TDNA extracted from the double-distilled water rinse solution of CT-guided percutaneous lung biopsy specimens can serve as a rapid and efficient nucleic acid source for NSCLC genotyping, enabling earlier support for clinical diagnosis and treatment.

Graphical abstract

关键词

穿刺组织浸洗液 / 核酸来源 / EGFR基因突变检测 / 非小细胞肺癌 / 活检

Key words

puncture tissue rinse solution / nucleic acid source / EGFR gene mutation detection / non-small cell lung cancer / biopsy

肺癌是全球病死率最高的恶性肿瘤^[1]。中国人群中肺癌男性发病率最高，女性发病率高于全球其他国家，5年生存率仅为21.7%^[2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的病理类型，占80%~85%。大多数NSCLC患者在首诊时已失去手术时机，晚期NSCLC的5年生存率仅为5%左右^[3]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)作为一种跨膜受体，其表达能激活下游重要信号通路，促使细胞分化、增殖及血管生成，参与肿瘤的发生、发展。EGFR基因是NSCLC的常见驱动基因，女性EGFR突变NSCLC患者占比显著高于男性，且亚洲人群的女性突变率最高(60%~65%)^[4-6]。EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)极大地改善了EGFR突变晚期NSCLC患者的预后。关于第1代(吉非替尼、厄洛替尼)、第2代(阿法替尼、达克替尼)和第3代(奥西替尼)EGFR-TKIs的研究^[7-9]显示，EGFR敏感突变患者的客观缓解率为60%~80%，无进展生存期为9.0~18.9个月。根据基因检测结果进行分子分型是实施靶向治疗的关键步骤，高敏感度和特异度的检测方法至关重要，有利于快速、准确地筛选出适合接受靶向药物治疗的患者群体。因此，开发便捷而快速的基因筛查方法具有重要的临床意义，可以帮助临床医师更高效地选择治疗方案，减少不必要的药物暴露，并最大限度地提高患者的治疗效果^[10]。NSCLC相关诊疗指南^[11-13]均强烈推荐，EGFR、ALK及ROS1等基因检测应在患者诊断为晚期NSCLC时即刻进行。

二代测序(next-generation sequencing，NGS)技术可同时检测多样本、多基因、多位点突变信息，已成为早期发现和诊断肺癌的重要工具，具有敏感度高、测序谱广等优点^[14-15]。NGS有助于同时评估多个生物标志物以全面地了解肿瘤异质性，并指导肺癌患者个体化治疗或进一步发现新的基因突变，辅助肿瘤发病机制研究，已被广泛应用于临床^[16-17]。临床可采用的核酸获取来源包括肿瘤组织石蜡标本、胸腔积液和腹水离心后的细胞学标本、血液、胸腔积液和腹水等体液中的游离DNA，应根据患者的具体病情和可及性进行选择^[18]。虽然组织活检是癌症诊断和辅助治疗的关键，但有时很难获得肿瘤组织，特别是在晚期肺癌中^[19]。对于一次活检未确诊或复发转移的肿瘤患者，往往需再次活检，然而，19.5%的患者无法再次活检，患者健康状况对于是否能进行活检至关重要^[20-21]。尽管基因检测，尤其是EGFR检测，是NSCLC患者的必需，但受检率仅为20%~30%，肿瘤异质性、取材困难、患者依从性差、检测周期长是其主要不足^[22]。

鉴于以上问题，本研究将穿刺活检组织标本的双蒸水浸洗液再次利用，提取DNA进行NGS分析，同时进行常规病理学检测，评估其可否成为NSCLC基因检测的核酸新来源，辅助或替代肿瘤组织进行基因分型检测。本研究拟将NSCLC穿刺活检针及组织标本条上黏附的外溢DNA浸洗液，应用液态活检技术进行驱动基因检测，以快速高效获得NSCLC的基因分型，并验证该方法的可行性，以期为后续病理诊断与治疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 伦理声明

本研究已获得中南大学湘雅二医院临床研究伦理委员会批准(审批号：LYG2024-0381)。在进行CT引导下经皮肺肿块穿刺前，所有患者或家属均签署知情同意书。

1.2 对象

收集2021年12月至2023年12月在中南大学湘雅二医院临床影像学诊断为晚期肺癌的患者29例。考虑到NSCLC人群的EGFR基因突变以不吸烟、女性、腺癌患者多见，采集的29例NSCLC均为女性患者，年龄为41~77岁，中位年龄为59岁。

1.3 方法

患者常规行CT引导下经皮肺肿块穿刺活检，取其穿刺活检针及活检标本的双蒸水浸洗液，离心后取上清液分离提取DNA，采用超扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(super amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction，Super-ARMS)法进行EGFR基因突变检测，DNA剩余量符合质控标准的组织标本进一步进行NGS基因检测。分析穿刺活检组织双蒸水浸洗液的基因检测结果与相应穿刺组织石蜡切片的NGS基因检测结果的一致性。此外，分别测定经皮肺穿刺活检标本及穿刺针浸洗液的DNA含量，比较二者的差异。

1.3.1 主要试剂与仪器

DNA分离试剂盒、人类EGFR突变基因检测试剂盒(多重荧光PCR法)和Hieff NGS Ultima DNA Library Prep Kit for MGI购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司；Q5000微量紫外分光光度计检测DNA含量；SLAN-96S全自动医用PCR分析系统进行上机检测。

1.3.2 样本采集

首先，对肺部肿块行CT引导下经皮穿刺，获取组织标本1~3条。将带有组织条的穿刺针置于含4 mL灭菌双蒸水的专用试管中浸洗2秒，收集组织浸洗液4 mL。以8 500 r/min离心1~3 min，去除细胞及杂质。离心后缓慢吸取上清液，枪头距管底沉淀物2~ 3 mm，避免吸起沉淀，将上清液转移至新离心管中。所得上清液可立即用于DNA提取检测，或置于-20 ℃保存备用。同时，将穿刺获取的组织条常规放入含10%甲醛溶液的保存瓶中，用于病理组织学检查，并以其作为对照进行组织基因检测。

1.3.3 DNA分离与收集

采用DNA分离试剂盒进行DNA提取，检测核酸浓度和质量。将DNA浓度稀释至2 ng/μL后用于后续检测。比较穿刺针浸洗液及组织浸洗液DNA含量的差异，最后3例患者均穿刺1针，取出组织后分别对穿刺组织及穿刺针浸洗液进行DNA含量测定。

1.3.4 Super-ARMS法EGFR基因检测

采用人类EGFR突变基因检测试剂盒(多重荧光PCR法)，使用全自动医用PCR分析仪进行检测。每次实验均同时设置阴性对照和阳性对照，检测结果根据试剂盒的判定标准进行评估。

1.3.5 NGS检测

29例穿刺组织石蜡切片及6例穿刺组织双蒸水浸洗溶液的DNA剩余量符合质控标准，可进一步行NGS基因检测。使用Hieff NGS Ultima DNALibrary Prep Kit for MGI(192 kit/瓶)进行文库构建；使用定制的探针组(integrated DNA technologies，ed3b)富集目标区域文库DNA；最后在DNBSEQ-T7RS测序仪(吉因加科技)上对靶向捕获的文库进行测序。

1.4 统计学处理

采用SPSS 28.0.1.1统计学软件对数据进行分析处理。计数资料以相对数(率/构成比)描述，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，非正态的计量资料以中位数(第1四分位数，第3四分位数)表示。采用McNemar检验(原假设“2种方法阳性率相等”)比较配对二分类资料的检出率差异；采用卡方检验(分类资料)或单因素ANOVA(正态分布的计量资料)比较多组间差异。突变率与分类资料的相关性分析采用卡方检验，与有序资料的相关性分析采用秩和检验，与连续资料的相关性分析采用Pearson(正态)/Spearman(秩)/Kendall’s tau(小样本有序)相关性系数，多因素调整用二元Logistic回归。计算敏感度(反映不漏诊能力)、特异度(反映不误诊能力)、约登指数(综合评价诊断方法判别能力，反映诊断方法好坏)及符合率(反映诊断方法整体判断正确的比例)。采用Kappa系数评价2种检测方法结果的一致性，该系数通过校正随机一致预期，量化了一致性强弱，Kappa值>0.60通常被认为具有良好的一致性。检验水准统一设置为α=0.05(双尾)，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Super-ARMS法检测穿刺组织浸洗液样本结果对比

经病理证实，腺癌患者28例，鳞状细胞癌患者1例。有1例穿刺2针样本(例21)，该患者经历2次活检及NGS，病理结果由肺腺癌转变为小细胞肺癌。分化程度方面，高分化患者8例，中分化7例，低分化14例。采样穿刺针数方面，取材1针的患者8例，取材2针的患者18例，取材3针的患者有3例(表1)。本研究穿刺活检标本组织双蒸水浸洗液Super-ARMS法的EGFR基因检测结果为阳性19例、阴性10例，组织石蜡样本NGS检测结果为EGFR基因阳性20例、阴性9例(表1)。

配对肿瘤组织NGS检测EGFR突变组和野生型组，在年龄、病理、分化程度、取材针数上的差异均无统计学意义(均P>0.05，表2)。

穿刺组织浸洗液Super-ARMS法对比组织石蜡样本NGS检测法的符合率为96.5%，敏感度为95%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为90%，约登指数为95%，准确率为96.5%。

2.2 穿刺针数与样本含量的相关性

本研究在收集前26例样本时，根据患者一般情况和样本质量确定穿刺针数。其中，穿刺1针的患者有5例，采集的组织浸洗液中分离的DNA含量为4.90~9.55(平均为7.07) ng/μL。穿刺2针的患者有17例，分离的DNA含量为2.70~36.55(平均为10.44) ng/μL。穿刺3针的患者有3例，分离的DNA含量为2.52~5.41(平均为4.14) ng/μL。1例穿刺2针，分离的DNA含量为153.55 ng/μL，在稀释100倍后进行EGFR检测，结果显示为强阳性。其余25例样本分离的DNA平均含量为14.58 ng/μL，最高含量出现在穿刺2针的样本中，为36.35 ng/μL，而最低含量出现在穿刺3针的样本中，为2.52 ng/μL。穿刺针数与样本DNA含量无显著相关性(P>0.05)。

2.3 6例组织浸洗液2种检测方法与组织NGS法的 结果一致性

采用Super-ARMS法进行EGFR基因突变检测，其中6例DNA剩余量符合质控标准，进一步进行了NGS基因检测(图1)。组织浸洗液样本的NGS基因检测结果显示有2例EGFR阳性和3例阴性，与Super-ARMS法完全一致，与组织石蜡样本的NGS检测结果相符(表3)。

2.4 3种方法与传统方法的时效性比较

采用穿刺活检组织浸洗液Super-ARMS法进行EGFR基因检测仅需1~2 d，而相应的NGS检测需 7 d，传统的组织石蜡样本NGS检测需14~15 d，穿刺组织浸洗液Super-ARMS法检测时间最短。

2.5 穿刺针浸洗液与穿刺组织浸洗液DNA含量对比

3例穿刺组织浸洗液DNA含量最高为15.65 ng/μL，最低为8.02 ng/μL，穿刺针浸洗液与穿刺组织浸洗液DNA含量差值最大为8.30 ng/μL，最小为0.12 ng/μL(表4)。

3 讨 论

在所有实体肿瘤的治疗中，NSCLC的精准治疗进展较快，相比之下，接受传统化学药物治疗的转移性NSCLC患者5年相对生存率仅约5%，然而，当患者接受精准靶向药物治疗后5年相对生存率达到15%至50%^[11]。EGFR突变的检测对于NSCLC的靶向治疗药物的选择至关重要^[23]。基于EGFR基因突变检测已成为NSCLC临床治疗与疗效评估的关键措施，目前NSCLC EGFR基因常见标本来源包括：1)肿瘤活检标本。EGFR突变分析的传统和金标准方法涉及从肿瘤活检标本中分离的DNA直接测序，主要包括手术、纤维支气管镜下活检、CT引导下经皮肺穿刺活检、胸腔镜、淋巴结穿刺活检等方法获取的组织标本^[24]。2)循环肿瘤细胞(circulating tumour cells，CTCs)。分析血液样本中的CTCs是检测EGFR突变的一种非侵入性方法，这种方法可以了解肿瘤异质性和治疗过程中突变状态的动态，可能有助于鉴定耐药机制，胸腔积液、痰、肺泡灌洗液所含脱落肿瘤细胞也可作为CTCs来源^[10]。3)体液中的游离DNA[循环游离DNA/循环肿瘤DNA(circulating free DNA/circulating tumor DNA，cfDNA/ctDNA)]。检测患者血液、胸腔积液、脑脊液、尿液、唾液、支气管灌洗液等体液中游离的DNA^[25]。尽管存在多种可选择的标本类型，但其来源在实际应用中仍面临一些限制：1)肿瘤组织石蜡标本进行检测前，肿瘤细胞比例不足则无法进行后续分析，而且再次获取这类样本相对较为困难；2)基于肿瘤组织进行分析要求较大的肿瘤负荷，更适用于晚期肿瘤的检测，微小病灶检出率并不高；3)NSCLC发生脑膜转移的患者，其血液、脑脊液或其他体液中ctDNA的含量通常较低，利用此类样本虽然有较高的特异度，但敏感度较低；同时脑转移患者通过腰椎穿刺获得脑脊液标本也存在一定的风险，可能发生脑疝等致死性并发症，需进一步评估；4)CTCs的临床实用性和与肿瘤活检结果的相关性需要进一步验证^[26]。

在NSCLC的临床诊断、治疗决策过程中，组织样本是检测EGFR基因突变的首选材料，但其使用受到多方面限制^[22]。开发其他可行的检测方法对于提高临床实际工作中EGFR突变检出率并优化患者管理至关重要。目前，对于部分晚期肺癌患者，主要的检测方法是对穿刺标本中的肿瘤细胞进行检测，进行病理分型及基因检测。通常情况下，细胞学样本制备过程中产生的穿刺组织浸洗液上清部分会被直接丢弃。这类样本中的游离DNA用于驱动基因检测的研究并不广泛。本研究使用穿刺组织浸洗液中的无细胞上清液进行EGFR驱动基因的液态活检技术检测。本研究中6例DNA剩余符合质控标准的样本完成了NGS检测，结果与组织活检结果一致。29例配对的组织浸洗液采用Super-ARMS平台行EGFR基因检测，结果显示19例阳性和10例阴性；而组织石蜡样本采用NGS平台行EGFR基因检测，结果为20例阳性和9例阴性。在比较组织浸洗液使用Super-ARMS技术与组织石蜡样本采用NGS技术进行EGFR基因检测的性能时，Super-ARMS技术的敏感度达到了95%，特异度和阳性预测值均为100%，阴性预测值为90%，整体准确率为96.5%，误诊率仅为3.5%。值得注意的是，本研究中1例组织与浸洗液结果不一致。笔者分析：组织阳性病理是NGS检测，是一种广谱的基因检测方法，其Panel覆盖了与肺癌相关的数百个基因，可查看具体位点和碱基变化及突变峰值；而本研究使用的Super-ARMS浸洗液是一个单基因、多位点的检测方法，其设计用于特异度检测EGFR基因的31个明确的热点突变位点。可查看该病例的突变位点是否包含在本研究Super-ARMS检测试剂范围内，若不包含，考虑因试剂检测范围较窄导致不一致；若包含，则与二者的敏感度有关，本例结果不一致考虑与试剂盒的敏感度相关。Lin等^[27]的报道指出，以组织检测结果作为标准，配对的胸腔积液上清液和沉渣联合检测EGFR基因突变的敏感度、特异度和一致率分别为92.3%、100%和95.5%。在比较上清液与沉渣中EGFR基因检测结果的一致性时，发现不一致率达18.2%，其中上清液的检测敏感度(92.3%)显著高于沉渣的敏感度(69.2%)。本研究采用穿刺组织浸洗液无细胞上清液的敏感度为95%，与上述研究结果具有一致性。

选择合适的样本类型对于临床迅速且精确地识别患者中驱动基因突变与否极为关键，这一过程对于挑选出符合靶向治疗条件的患者具有重大临床价值。目前临床中也使用血液标本进行NSCLC基因突变的补充检测，但多项回顾性研究^[28-29]发现，血浆中的ctDNA含量较低，当仅存在胸内肿瘤或脑转移时尤其如此，敏感度较低，特异度随肿瘤负荷增大而增大。Nair等^[30]检测了支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)中存在的EGFR基因突变，结果表明BAL来源的cfDNA含量更高，BAL突变的检测频率显著高于血浆cfDNA，提示ctDNA在不同体液来源中含量可能不同，在靠近转移部位的体液中测量突变可能得到更满意的效果。Guibert等^[31]对细针穿刺技术(fine-needle aspiration，FNA)样本进行研究，提取FNA上清cfDNA，并分别采用液滴数字聚合酶链反应(digital droplet polymerase chain reaction，ddPCR)和NGS进行EGFR、BRAF和KRAS突变的检测。研究纳入11例疑似肺癌患者及6例确诊肺癌伴治疗耐药患者的FNA样本，结果显示：6份初诊腺癌样本中，4份经组织检测证实存在驱动基因突变(1例EGFR、2例KRAS、1例HER2)；5例EGFR治疗耐药样本及3例携带EGFR 20外显子T790M突变样本均检出EGFR驱动基因。该研究提示，FNA上清cfDNA检测有助于提高细针穿刺活检组织的确诊率。外周血cfDNA含量较低，健康个体中外周血cfDNA含量为(3.12±1.02) ng/mL^[32]，肿瘤患者外周血cfDNA含量高于健康个体，且随着分期增加^[33]。不同分型的肿瘤cfDNA含量也不相同，如口咽鳞状细胞癌患者cfDNA含量[(9.60±6.23) ng/mL]高于其他类型头颈部鳞癌[(7.67±4.44) ng/mL]，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)患者cfDNA含量[(24.12±4.98) ng/mL]显著高于非TNBC患者[(15.36±4.12) ng/mL]^[26]。在穿刺组织的无细胞上清液中，存在可进行分子检测的cfDNA，利用此种核酸来源途径能够弥补穿刺样本中细胞数量不足、操作繁琐及重复性低等问题。因此，利用穿刺组织无细胞上清液进行分子检测不仅具有潜在的临床应用前景，而且为患者提供了一种更为便捷、可靠的检测选择。

Yamaguchi等^[34]提取甲状腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、转移淋巴结FNA的无细胞上清液及恶性积液(腹水、胸腔积液、脑脊液)残余液基细胞学标本行NGS检测，证实基于FNA的液基细胞学标本可作为癌症基因组分析的替代来源，尤其适用于临床重症患者。当细胞量少或活检样本不足时，FNA上清液可作为补充来源，其分子分析可辅助诊断，降低取样可变性、提升准确率，尤其适用于高度怀疑恶性肿瘤但涂片非典型细胞有限者。本研究取CT引导下经皮肺细针穿刺活检所获穿刺针及组织条外溢DNA浸洗液，采用血浆/胸腔积液适用DNA提取试剂盒分离无细胞cfDNA。结果显示，穿刺组织无细胞上清液cfDNA含量显著高于血浆来源，需按PCR推荐最佳浓度 (2 ng/μL)稀释以适配检测范围，确保内控与阳性控制达标。29例样本平均DNA含量为14.58(2.52~ 153.55) ng/μL，最高值见于2针样本，最低值见于3针样本，且含量与穿刺针数无正相关性——1针样本含量亦满足临床检测需求。1例2针样本含量达153 ng/μL(患者2次活检病理由肺腺癌转为小细胞肺癌)，提示浸洗液cfDNA质量与数量均符合高敏感度Super-ARMS分析标准；含量与针数无关或与组织质量相关。符合质控标准的无细胞上清液可稳定用于NGS检测。Zhang等^[35]通过应用高通量测序技术，对比了肺腺癌患者胸腔积液、腹水、心包积液以及脑脊液样本中EGFR基因突变的情况。在本研究中，组织浸洗液上清液样本采用Super-ARMS法进行EGFR基因突变检测后，6例样本符合质控标准，进一步进行NGS基因检测。结果显示其中3例为EGFR突变型，3例为野生型，与Super-ARMS平台检测结果相符。与对比组石蜡组织样本NGS检测EGFR结果完全一致。因此，在临床实践中，当组织取样困难、标本有限时，采用组织浸洗液这一途径或许可以解决这一问题。一份组织样本就可以满足病理和基因检测的双重需求，从而为患者提供尽早诊断与治疗的机会与依据。

2022年欧洲肿瘤医学学会(European Society for Medical Oncology，ESMO)^[36]指出，ctDNA检测可用于“未接受治疗的患者，尤其建议在获得肿瘤组织进行基因分型可能会有明显延迟，侵入性手术可能有风险或有禁忌，或骨骼是唯一可以进行活检的部位时”。然而，小体积肿瘤可导致假阴性结果。欧美国家的指南共识^[37]认为可应用血浆ctDNA标本进行NSCLC EGFR检测，但存在一些限制和假阴性的风险，值得重视的是，在没有足够的组织学证据得到恶性诊断及病理分型时，若得到阳性结果可考虑直接使用EGFR-TKIs治疗。在一项涉及180例晚期非鳞状NSCLC患者的单中心前瞻性试验^[38]中，初始采血和即刻血浆ddPCR检测EGFR外显子19 del、L858R、T790M和/或KRAS G12X，ctDNA对EGFR 19 del和L858R突变的特异度均为100%；EGFR 19 del的敏感度为82%，L858R突变的敏感度为74%。本研究的敏感度较血浆ctDNA检测EGFR突变更高，更能代表NSCLC的突变状态，在临床中的价值更高。

本研究在时间效率上与传统方法相比具有显著的高效性。传统使用病理组织石蜡标本进行基因检测前需先进行肿瘤细胞鉴定，然后再行基因检测，整个周期通常需15 d。相比之下，本研究采用组织标本浸洗液无细胞上清液，在穿刺时即可进行采集，实现了即采即用。利用Super-ARMS法进行EGFR基因检测仅需1~2 d，而相应的NGS检测需时7 d。本研究的高效检测方法为患者及时获得EGFR-TKIs靶向治疗赢得了宝贵的时间，在晚期或病情急剧恶化患者中可能存在获益，同时也为后续的病理学诊断与治疗提供了可靠的依据。这种快速的基因检测方法有助于加快诊断速度，提供更及时的治疗指导，从而改善患者的治疗效果。

本研究分析了3例样本中穿刺组织外溢DNA与穿刺针附着DNA含量的差异。结果显示，3组数据DNA含量均存在差异，其中2组数据显示组织与穿刺针的DNA含量差异较大，提示穿刺组织外溢DNA含量可能更高。研究者^[39]曾使用CT引导的活检针的洗液检测NSCLC患者的EGFR基因突变情况，结果表明穿刺针洗液的DNA含量满足进行EGFR检测的要求，从而验证了活检针的洗液检测EGFR突变的可行性。因此，采用这种方式，即使在极小的临床标本中，也可以使用高敏感度的测定来确定DNA基因型。本研究结果显示，组织浸洗液中的cfDNA含量高于穿刺针，同时2类DNA标本均可完成该检测，并且检测结果与病理结果一致。本研究还利用符合标准的cfDNA完成了NGS测序，结果也与后续病理组织结果一致。这些发现表明，穿刺组织外溢液和穿刺针附着液都是可行的EGFR检测样本来源，混合标本可能更适合进行NGS测序。相较于以往利用组织细胞、血液样本或其他体液游离DNA进行基因检测的方法，本研究提供了一种更为有效的检测方法。通过采用穿刺组织外溢液和穿刺针附着液的混合标本，可以获得更高含量的cfDNA，更准确地进行EGFR基因检测和NGS测序，为临床诊断和治疗提供了可靠的检测手段。

本研究仍存在一些局限，例如样本量少、仅包含女性病例、只分析了恶性病例情况等。本研究主要分析EGFR突变情况，未描述其他突变情况，不能全面指导靶向药物治疗；DNA含量的不稳定可能会影响后续分析的准确性和可靠性；在DNA提取方面，双蒸水浸洗可能导致细胞膜破损，提取的核酸可能包含细胞内遗传物质。

利用CT引导下经皮肺穿刺活检标本的双蒸水浸洗液所提取的DNA，可作为快速高效获得NSCLC基因分型的核酸标本来源，尽早为临床诊疗提供依据，这是目前获取患者基因类型最快的方法。因此，穿刺活检组织浸洗液可以成为NSCLC基因检测和靶向治疗的新DNA来源。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2020JJ4817┫。This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province)

湖南省自然科学基金(China ┣2020JJ4817)

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