SESN2对Erastin诱导的肾小管细胞铁死亡和急性肾损伤的保护作用

摘要

目的：如何防治围手术期常发生的急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）一直是临床实践关注的核心。本研究旨在探讨应激诱导蛋白2（sestrin2,SESN2）在铁死亡诱导剂Erastin诱导的肾小管细胞铁死亡和ICR小鼠AKI中的作用及机制。方法：体外试验方面，采用稳定转染慢病毒的人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2，分为体外对照组、Erastin体外模型组、SESN2体外干预组3组。体外对照组采用空载体慢病毒LV-Con进行转染；Erastin体外模型组转染LV-Con后给予10μmol/L的Erastin，处理24 h;SESN2体外干预组转染SESN2过表达慢病毒LV-SESN2后，同样给予10μmol/L的Erastin进行处理。体内试验方面，通过检测血肌酐（serum creatinine,SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）水平验证和评估Erastin诱导的AKI小鼠模型的成功建立后，将18只健康成年ICR雄性小鼠随机分为体内对照组、Erastin体内模型组、SESN2体内干预组3组，每组各6只。体内对照组采用尾静脉注射空载对照病毒AAV9-Con;Erastin体内模型组采用尾静脉注射AAV9-Con,4周后腹腔注射Erastin（30 mg/kg）;SESN2体内干预组采用尾静脉注射SESN2过表达病毒AAV9-Sesn2,4周后腹腔注射Erastin（剂量同Erastin体内模型组）。造模成功24 h后收集血清和肾组织。采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞和组织的上清液乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、白细胞介素（interleukin,IL）-6及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α水平。采用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）荧光探针法和二氢乙啶（dihydroethidium,DHE）荧光染色法检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）的荧光强度。采用比色法检测丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、亚铁离子(Fe²⁺)水平；采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,Annexin V-FITC/PI）、原位末端转移酶标记法（terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL）和双染流式细胞术计算细胞凋亡率。采用实时反转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR）及蛋白质印迹法检测SESN2、核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase4,GPX4）和铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1,FSP1）的m RNA及蛋白质表达情况。结果：与体外/体内对照组相比，Erastin体外/体内模型组和SESN体外/体内干预组的LDH、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、Fe²⁺水平均显著升高，GSH水平显著降低，细胞凋亡率显著增加（均P<0.001）;GPX4、FSP1的mRNA和蛋白质表达水平均显著降低，SESN2及Nrf2的m RNA和蛋白质表达水平均显著升高（均P<0.001）。同时，与Erastin体外/体内模型组相比，SESN2体外/体内干预组中LDH、IL-6、TNF-α、MDA、ROS、Fe²⁺水平均显著降低，GSH水平显著升高，细胞凋亡率显著降低（均P<0.001）,SESN2、Nrf2、GPX4、FSP1的mRNA和蛋白质表达水平均显著升高（均P<0.001）。结论：SESN2可通过激活Nrf2信号通路，上调铁死亡相关分子GPX4和FSP1的表达，抑制氧化应激、脂质过氧化及炎症反应，从而减轻Erastin诱导的肾小管细胞铁死亡，对铁死亡相关AKI产生保护作用。

关键词

应激诱导蛋白2 / 铁死亡诱导剂 / 铁死亡 / 人肾皮质近曲小管上皮细胞 / 急性肾损伤 / 谷胱甘肽过氧化物酶4 / 铁死亡抑制蛋白1