线粒体抗氧化剂Visomitin对肠球菌的体外和体内抗菌作用

摘要

目的：随着肠球菌对抗生素的耐药性不断攀升，新型抗菌药物的挖掘已成为研究热点。本研究旨在通过药物重新利用，探究靶向线粒体的抗氧化剂Visomitin对肠球菌的体外和体内抗菌活性。方法：肠球菌临床菌株分离自中南大学湘雅三医院住院患者。首先，通过微量肉汤稀释实验、纸片扩散实验和时间-杀菌曲线探究Visomitin对肠球菌的抗菌敏感性及其杀菌效率。通过连续诱导耐药实验检测亚抑菌浓度的Visomitin对肠球菌的耐药诱导作用。通过蛋白酶定量实验检测Visomitin对肠球菌蛋白酶产生的抑制作用。随后，通过结晶紫染色和SYTO9荧光探针检测Visomitin对肠球菌生物膜的抑制和清除作用。最后，通过构建小鼠皮下脓肿模型，检测Visomitin对肠球菌的体内抗菌活性。结果：Visomitin对肠球菌具有良好的体外抗菌活性，其最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度分别为4～8μg/mL和4～16μg/mL。纸片扩散实验提示Visomitin对肠球菌的生长具有剂量依赖的抑制活性，时间-杀菌曲线进一步显示Visomitin对肠球菌具有浓度和时间依赖的杀菌活性。2×MIC浓度的Visomitin与肠球菌标准菌株ATCC 19434和ATCC 29212分别作用2 h和12 h均可将活菌量降低到最低检测限以下。虽然万古霉素可诱导肠球菌的耐药性增加，但亚抑菌浓度的Visomitin连续传代14次，仍未见明显的耐药诱导作用。亚抑菌浓度的Visomitin还可明显抑制肠球菌蛋白酶的生成，Visomitin在1/8×MIC浓度时可使ATCC 19434蛋白酶产量由100%±2.01%降至96.25%±1.16%(q=3.661,P<0.05)，而在1/2×MIC浓度下则使ATCC 29212蛋白酶产量由100%±2.95%降至41.49%±0.45%(q=35.790,P<0.001)。结晶紫染色提示，1×MIC～4×MIC浓度的Visomitin可显著抑制肠球菌生物膜的形成；当其浓度上升至2×MIC～4×MIC时，能不同程度清除已形成的生物膜。SYTO9荧光探针进一步验证了Visomitin对肠球菌的抗生物膜活性。此外，Visomitin可显著降低小鼠脓肿大小和活菌载量，与仅注射溶媒的对照组相比，Visomitin可使菌载量从[2.90(2.52, 3.18)]×10～7 CFU/abscess降低到[1.56(0.35,4.78)]×10～6 CFU/abscess(U=0.000,P<0.01)。苏木精-伊红染色结果提示，Visomitin能明显减少脓肿组织中的炎症细胞浸润。结论：Visomitin对肠球菌具有良好的体外和体内抗菌活性，且不易诱导耐药产生，具备再利用潜力，为其可能成为临床治疗难治性肠球菌感染的新型候选药物提供了重要的临床前证据。

关键词

药物重新利用 / Visomitin / 肠球菌 / 生物膜 / 感染模型 / 体内