靶向ABCB6通过HIF1A/GPX4通路诱导骨肉瘤细胞铁死亡（英文）

摘要

目的：骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是好发于青少年的恶性骨肿瘤，因其早期转移倾向和化疗耐药性，患者远期生存水平长期未见明显提高，亟需探索新的分子靶点和治疗策略。铁死亡作为一种铁依赖性脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式，为攻克耐药性肿瘤提供了新的方向。ATP结合盒亚家族成员B6（ATP-binding cassette subfamily B member 6,ABCB6）隶属于ATP结合盒（ATP-binding cassette,ABC）转运蛋白超家族，主要定位于线粒体外膜，参与血红素合成与铁离子胞内转运。近年来研究提示ABCB6在多种肿瘤中异常表达并调控肿瘤恶性进展，但其在OS中的作用及机制尚不明确。本研究旨在系统阐明ABCB6在OS中的表达特征、临床预后意义及生物学功能，深入探究ABCB6调控OS铁死亡的分子机制，以期为由ABCB6介导的OS靶向治疗提供理论依据。方法：采用人OS细胞系HOS和143B及人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）作为研究对象。通过慢病毒介导的RNA干扰技术建立ABCB6稳定敲减的OS细胞株，并利用缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF1A）过表达慢病毒进行回补实验。通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）增殖实验、平板克隆形成实验评估细胞增殖能力；Transwell小室迁移实验和划痕愈合实验检测细胞迁移能力；流式细胞术检测细胞凋亡。利用铁死亡相关表型实验探索ABCB6表达对OS铁死亡的影响。通过转录组测序分析差异表达基因及富集通路；免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因实验验证HIF1A蛋白对谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）启动子的直接结合与转录调控。采用铁螯合剂和蛋白酶体抑制剂干预以验证Fe²⁺对HIF1A蛋白稳定性的调控。体内实验中，将ABCB6敲减及对照的143B细胞接种于裸鼠皮下，通过建立异种移植瘤模型评估ABCB6表达对OS体内生长的影响。结果：ABCB6在OS细胞系中的信使RNA（messenger RNA,mRNA）和蛋白质表达水平均显著高于BMSCs（均P<0.05），且TARGET（Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments）-OS队列分析显示ABCB6高表达组患者总生存期显著低于ABCB6低表达组[风险比（hazard ratio,HR）=2.94,95%置信区间（confidence interval,CI） 1.36～6.36,P<0.05]。ABCB6敲减显著抑制OS细胞增殖和克隆形成，降低迁移能力，增加细胞凋亡率，并伴随神经钙黏素（N-cadherin）下调和上皮钙黏素（E-cadherin）及活化型胱天蛋白酶-3（cleaved caspase-3）上调（均P<0.05）。ABCB6敲减使Liperfluo阳性细胞比例和二氢乙锭（dihydroethidium,DHE）氧化水平显著升高，胞内Fe²⁺浓度增加，谷胱甘肽（glutathione,GSH）/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）比值下降，线粒体膜电位降低，电镜下可见线粒体萎缩、嵴减少等典型铁死亡形态学改变；铁死亡抑制剂可逆转上述氧化应激变化（均P<0.05）。ABCB6敲减下调GPX4蛋白和mRNA水平（均P<0.05），但对溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11,SLC7A11）无显著影响（P>0.05）。转录组测序及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析显示HIF-1信号通路在对照组中显著富集（P<0.001）;ABCB6敲减使HIF1A蛋白表达降低，而铁螯合剂和蛋白酶体抑制剂处理可分别通过螯合Fe²⁺和抑制泛素-蛋白酶体途径逆转该降解过程（均P<0.05）。染色质免疫共沉淀结合定量聚合酶链反应（chromatin immunoprecipitation followed by quantitative polymerase chain reaction,ChIP-qPCR）和双荧光素酶报告基因实验证实HIF1A可直接结合GPX4启动子并激活其转录。在ABCB6敲减细胞中过表达HIF1A可恢复GPX4表达，并显著逆转ABCB6敲减所导致的增殖抑制、迁移能力下降和凋亡增加，同时恢复线粒体膜电位（均P<0.05）。裸鼠异种移植瘤实验表明，ABCB6敲减组的肿瘤体积和瘤重均显著小于对照组（均P<0.05）；免疫组织化学染色证实ABCB6敲减组中HIF1A和GPX4表达下调，Ki-67和N-cadherin阳性率降低，cleaved caspase-3和E-cadherin阳性率升高（均P<0.05）。结论：本研究首次系统揭示了ABCB6在OS中的致癌功能和预后预测价值，阐明了“ABCB6/Fe²⁺/HIF1A/GPX4”信号轴调控OS铁死亡的完整分子机制。本研究不仅为OS的分子分型和预后评估提供了新的生物标志物，也为靶向ABCB6/HIF1A/GPX4轴诱导铁死亡的治疗策略奠定了理论基础。后续可进一步探索ABCB6上游调控机制及其在OS化疗耐药逆转中的潜在应用价值。

关键词

骨肉瘤 / ABCB6 / 铁死亡 / HIF1A / GPX4

基金资助

supported by the Health High-Level Talent Scientific Research Project of Hunan Province (R2023175); the Science and Technology Innovation Plan Project of Hunan Province (2023SK2023),China