去泛素化酶USP30通过调控MFN2泛素化减轻脑出血所致脑损伤

赵静; 蒋正; 陈春丽

中南大学学报（医学版） ›› 2026, Vol. 51 ›› Issue (6) : 1176 -1191.

赵静, 蒋正, 陈春丽

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摘要

目的：脑出血是一种致残率和病死率均较高的脑卒中类型。线粒体功能障碍在脑出血后继发性脑损伤中发挥重要作用，保护线粒体功能被认为是一种潜在的治疗策略。泛素特异性蛋白酶30(ubiquitin-specific protease30,USP30)是一种定位于线粒体外膜的去泛素化酶，在调控线粒体稳态中具有重要作用。本研究旨在探讨USP30在脑出血后的作用及其潜在分子机制。方法：采用血红素诱导的SH-SY5Y细胞模型和Ⅳ型胶原酶诱导的大鼠脑出血模型开展体内外实验。体外实验：将SH-SY5Y细胞分为对照组、血红素处理24 h组和血红素处理48 h组，采用蛋白质印迹法和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测线粒体融合蛋白质2(mitofusin 2,MFN2)表达及其泛素化水平。为验证USP30过表达效率，将未接受血红素处理的SH-SY5Y细胞分别转染空载体或USP30-Flag质粒48 h，分为control+vector组和control+USP30组，采用蛋白质印迹法检测USP30蛋白表达。随后将细胞分为对照组、血红素组、血红素+空载体组和血红素+USP30过表达组，后2组均在USP30-Flag质粒或空载体转染48 h后给予血红素处理。采用细胞计数试剂盒8法检测细胞活力，采用三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及MitoSOX试剂盒评估线粒体功能，采用Mito-Tracker染色和透射电子显微镜观察线粒体形态，并采用蛋白质印迹法和Co-IP检测相关蛋白质表达及MFN2泛素化水平。体内实验：将大鼠分为假手术组和脑出血3 d组，采用蛋白质印迹法和Co-IP检测血肿周围组织中MFN2表达及其泛素化水平。随后将大鼠分为假手术组、脑出血组、脑出血+腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)-NC组和脑出血+AAV-USP30组，后2组均于脑出血建模前20 d经侧脑室注射AAV-USP30或AAV-NC。于脑出血后第3天采用改良Garcia评分评估神经功能，采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)染色评估组织学损伤及细胞凋亡，采用ATP和ROS水平检测、ATP5H免疫荧光和透射电子显微镜分别评估线粒体功能和超微结构，并采用蛋白质印迹法和Co-IP检测相关蛋白质表达及线粒体MFN2泛素化水平。结果：体外实验中，与对照组相比，血红素处理24和48 h后，SH-SY5Y细胞中MFN2泛素化水平显著升高，而MFN2蛋白表达显著降低(均P<0.01)。与血红素+空载体组相比，USP30过表达显著提高SH-SY5Y细胞活力，降低细胞内ROS及线粒体ROS水平，增加ATP含量，并减轻线粒体碎片化及超微结构损伤(均P<0.05)。同时，USP30过表达降低MFN2泛素化水平、上调MFN2和B细胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达(均P<0.05)，下调Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)和cleaved caspase-3表达(均P<0.05)。体内实验中，与假手术组相比，脑出血后第3天大鼠血肿周围组织中MFN2泛素化水平显著升高，而MFN2蛋白表达显著降低(均P<0.01)。与脑出血+AAV-NC组相比，AAV-USP30显著改善神经功能缺损，减轻血肿周围组织学损伤，减少TUNEL阳性细胞(均P<0.05)；同时降低ROS水平，提高ATP含量和ATP5H表达水平，并改善线粒体肿胀、空泡化及嵴结构破坏。AAVUSP30还降低MFN2泛素化水平、上调MFN2和Bcl-2表达，并下调Bax及cleaved caspase-3表达(均P<0.05)。结论：脑出血急性期可伴随MFN2泛素化增强和蛋白质表达下降，可能参与线粒体结构和功能损伤。USP30通过抑制MFN2的泛素化及其降解，维持线粒体结构和功能完整性，从而减轻脑出血诱导的脑损伤。USP30可能是脑出血治疗的潜在分子靶点。