AHR介导的FOXP3组蛋白乙酰化在系统性红斑狼疮Tfr细胞分化中的作用

任睿健, 饶钰, 胡凌雪, 刘宇航, 贺治杰, 丁澍

中南大学学报（医学版） ›› 2026, Vol. 51 ›› Issue (7) : 1377 -1391.

任睿健, 饶钰, 胡凌雪, 刘宇航, 贺治杰, 丁澍

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摘要

目的：系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种以自身抗体异常生成、免疫失衡及多系统受累为主要特征的慢性自身免疫性疾病。本研究旨在探究芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor,AHR）激活对SLE患者滤泡调节性T（T follicular regulatory,Tfr）细胞分化和叉头框蛋白P3（forkhead box protein P3,FOXP3）表达的影响，并从表观遗传学角度阐明其内在分子机制。方法：选取2025年6月至12月于中南大学湘雅三医院皮肤科及风湿免疫科就诊的SLE患者18例及健康体检者18例，并招募健康志愿者3例收集外周血完成机制部分研究。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，分选CD4⁺T细胞。采用流式细胞术检测Tfr细胞比例（Tfr%）及FOXP3、AHR的表达水平，并分析其与疾病活动度的相关性。体外分离健康人CD4+T细胞，分为Control组[二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）处理]、ITE组{AHR激动剂2-（1’H-吲哚-3’-羰基）噻唑-4-羧酸甲酯[2-（1’H-Indol-3’-ylcarbonyl）-4-thiazolecarboxylic acid methyl ester,ITE]处理}、A-485组（P300抑制剂A-485处理）及ITE+A-485组（ITE、A-485共处理），采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法、流式细胞术、蛋白质印迹法及实时反转录聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）检测细胞增殖活性、Tfr%及相应T细胞中FOXP3、AHR蛋白与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4,CTLA-4）及白细胞介素10（interleukin-10,IL-10）的mRNA表达水平。将AHR、P300过表达质粒共转染至健康人CD4⁺T细胞中，采用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）验证AHR与P300的蛋白质相互作用。采用染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）-PCR验证AHR、P300在FOXP3启动子区结合位点，ChIP-定量PCR（quantitative PCR,qPCR）检测各组健康人CD4⁺T细胞AHR、P300在FOXP3启动子区域的结合水平及组蛋白乙酰化水平。收集SLE患者外周血CD4⁺T细胞，经CD3/CD28 T细胞激活磁珠活化后，分别给予DMSO与ITE处理。采用流式细胞术检测SLE患者CD4⁺T细胞中Tfr%、FOXP3表达水平，采用ChIP-qPCR检测AHR、P300在FOXP3启动子区域的结合水平及组蛋白乙酰化水平。结果：与健康对照组相比，SLE患者外周血CD4⁺T细胞中Tfr%显著降低（P<0.001），且与SLE疾病活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI）呈负相关（r=-0.803,P<0.001）;Tfr细胞中FOXP3和AHR蛋白表达水平均显著下调（均P<0.01），且二者呈正相关（r=0.596,P<0.05）。CCK-8法结果显示ITE在0～349.27 nmol/L浓度范围内、A-485在0～93.20 nmol/L浓度范围内对CD4⁺T细胞增殖活性无明显影响（均P>0.05）。体外实验结果显示，与Control组相比，ITE组Tfr%、AHR、FOXP3蛋白，以及CTLA-4、IL-10的mRNA表达水平均显著上调（均P<0.05）。Co-IP实验证实，AHR与P300在CD4⁺T细胞中存在蛋白质相互作用。ChIP-PCR结果显示，AHR在FOXP3启动子区域-78 bp至-263 bp及-431 bp至-596 bp区段存在结合位点，P300可结合至FOXP3启动子区域-78 bp至-263 bp区段。ChIP-qPCR结果显示，与Control组相比，ITE组FOXP3启动子区域组蛋白H3尾部赖氨酸残基（H3K9ac、H3K14ac）的乙酰化水平及AHR、P300结合水平均显著升高（均P<0.05）,A-485组FOXP3启动子区域H3K9ac、H3K14ac乙酰化水平及P300结合水平均显著降低（均P<0.05）,AHR结合水平无明显变化（P>0.05）。功能挽救实验结果显示，与ITE组相比，ITE+A-485组FOXP3蛋白表达水平及Tfr%均显著降低（均P<0.05）,FOXP3启动子区域H3K9ac、H3K14ac乙酰化水平及P300结合水平均显著降低（均P<0.05）,AHR结合水平无明显变化（P>0.05）；与A-485组相比，ITE+A-485组FOXP3启动子区AHR结合水平及FOXP3蛋白表达水平均显著上调（均P<0.05），但低于ITE组，FOXP3启动子区H3K9ac、H3K14ac乙酰化水平及P300结合水平均无明显变化（均P>0.05）。在SLE患者CD4⁺T细胞中验证发现，ITE处理后，Tfr%升高、FOXP3表达上调，FOXP3启动子区乙酰化水平、AHR及P300结合水平均升高（均P<0.05），与上述结果一致。结论：SLE患者外周血CD4⁺T细胞中Tfr%降低及FOXP3表达下降可能与AHR表达不足有关。AHR激活可促进FOXP3表达并诱导Tfr细胞分化，其作用可能与AHR募集P300至FOXP3启动子区域并增强局部组蛋白乙酰化有关。