骨关节炎软骨下骨细胞中Wnt 5a/Smad 2/3激活及Sclerostin的抑制促进骨小梁硬化

摘要

目的 探讨骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨下骨细胞通过激活非经典Wnt信号通路抑制硬化蛋白(sclerostin)促进骨小梁硬化的机制。方法 建立软骨细胞-成骨细胞共培养体系,细胞实验分组:Control组、 OE-vector组、 LIF OE组、 shRNA-NC组、 shRNA-LIF组;通过RNA免疫共沉淀(RIP)检测LIFR与Sclerostin编码基因SOSTm RNA的直接相互作用; qRT-PCR检测SOSTm RNA的表达水平;软骨细胞过表达/敲低LIF,蛋白质印迹检测软骨细胞中LIF和LIFR及成骨细胞中Sclerostin的表达。40只7～8周龄雄性C57BL 6J小鼠随机分为诱导4周和8周的对照组、假手术组、模型组,及诱导8周的模型+LIFR拮抗剂处理组; Micro-CT检测小鼠关节骨体积分数(BV/TV)、小梁骨厚度(Tb. Th)和小梁骨数量(Tb. N);HE染色和番红O-固绿染色观察小鼠关节组织并进行组织病理学分析;蛋白质印迹检测Wnt 5a、 Smad 2/3、Sclerostin、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)/LIF受体(LIF receptor, LIFR)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinases 13,MMP-13)蛋白的相对表达水平。结果 RIP实验结果显示LIFR与SOSTm RNA有直接相互作用。LIF过表达后LIFR表达水平升高(P<0.05), Sclerostin表达水平降低(P<0.05); LIF敲低后以上结果相反。模型诱导8周后,模型组小鼠后肢骨关节部位相比于假手术组BV/TV和Tb. Th升高(P<0.05), Tb. N降低(P> 0.05);模型+LIFR拮抗剂处理组小鼠后肢骨关节部位相比于模型组BV/TV和Tb. Th降低(P<0.05), Tb. N升高(P> 0.05)。HE染色和番红O-固绿染色结果显示,模型组软骨被破坏,细胞间基质降解,细胞排列紊乱,软骨层解体,软骨下骨受累;模型+LIFR拮抗剂处理组软骨表面区和增殖区被破坏,但软骨肥大带相对完整,提示LIFR拮抗剂处理后软骨区域破坏相对缓解。4周或8周后,模型组Wnt 5a、p-Smad 2/3表达水平相比于假手术组升高(P<0.05), Sclerostin表达水平降低(P<0.05), LIF、 LIFR、TRAP、 MMP-13表达水平升高(P<0.05)。结论 软骨下骨细胞可能通过激活Wnt 5a/Smad 2/3上调LIF抑制Sclerostin,促进骨小梁硬化。

关键词

骨关节炎 / 软骨下骨 / 骨小梁硬化 / 硬化蛋白 / 白血病抑制因子