胰管注射AAV8-gRNA实现胰岛β细胞Adra2a基因编辑

摘要

目的 旨在利用CRISPR/Cas9系统通过腺相关病毒8型(adeno-associated virus serotype 8,AAV8)携带靶向Adra2a基因的向导RNA (guide RNA, gRNA)实现胰岛β细胞特异性基因敲除。方法 本研究采用RIP2 (rat insulin Ⅱ promoter)-Cre; Cas9KI/+小鼠模型,其中RIP2启动子驱动Cre重组酶在胰腺β细胞中特异性表达,进而激活Cas9酶的表达,实现Cas9在β细胞内的特异性表达。为实现Adra2a基因的高效编辑,使用免疫原性较低的腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)作为递送载体,通过胰腺导管注射携带针对Adra2a基因的gRNA的AAV8病毒颗粒,从而在β细胞中实现对目标基因的特异性敲除。结果 通过胰腺导管注射技术成功地在小鼠胰岛中实现了Cas9系统介导的靶基因破坏。通过组织切片观察,确认了胰腺注射后GFP标记的成功表达,且未见肝脏和脾脏有GFP信号,表明病毒通过胰管注射效果良好。通过PCR分析,胰岛样本中成功检测到Cas9介导的靶基因破坏,且Adra2a蛋白水平在实验组小鼠胰岛中显著下调。结论 通过胰腺导管注射携带gRNA的腺相关病毒到RIP2-Cre; Cas9KI/+小鼠,可以实现胰岛β细胞特异性基因敲除,为未来胰岛基因功能研究提供了有效的技术支持。

关键词

基因编辑 / CRISPR-Cas9 / 腺相关病毒 / β细胞