利用HuC：RFP标记技术研究 Nde1 基因敲除斑马鱼的神经发育异常

刘婷; 张琦; 林佳; 张颖蓝; 李强

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2025.06.003

复旦学报（医学版） ›› 2025, Vol. 52 ›› Issue (06) : 794 -802. DOI: 10.3969/j.issn.1672-8467.2025.06.003

论著

利用HuC：RFP标记技术研究 Nde1 基因敲除斑马鱼的神经发育异常

刘婷 ¹^,²^,³^,⁴ ,
张琦 ¹^,²^,³^,⁴ ,
林佳 ¹^,²^,³^,⁴ ,
张颖蓝 ¹^,²^,³^,⁴ ,
李强 ¹^,²^,³^,⁴

作者信息 +

Investigation of neural developmental abnormalities in Nde1 knockout zebrafish using HuC： RFP labeling technology

Ting LIU ¹^,²^,³^,⁴ ,
Qi ZHANG ¹^,²^,³^,⁴ ,
Jia LIN ¹^,²^,³^,⁴ ,
Ying-lan ZHANG ¹^,²^,³^,⁴ ,
Qiang LI ¹^,²^,³^,⁴

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摘要

目的通过可视化斑马鱼神经网络发育过程，探索Nde1基因敲除对斑马鱼早期神经发育的影响。方法利用Nde1^-/-与Tg（HuC：RFP^+/-）构建Tg （Nde1^-/-；HuC：RFP^+/-）转基因斑马鱼，HuC启动子驱动神经元表达红色荧光蛋白，直观观察斑马鱼神经网络，追踪斑马鱼神经发育情况，并通过Image J及Prism比较Nde1基因敲除斑马鱼与野生型斑马鱼神经元核团的平均荧光强度及荧光报告蛋白表达量，分析Nde1基因敲除对斑马鱼早期神经发育的影响。结果从斑马鱼胚胎受精后48 h观察到受精后7天，发现Nde1基因敲除斑马鱼的三叉感觉神经元核团以及脊髓神经元核团的平均荧光强度均低于野生型斑马鱼，RT-qPCR结果也显示红色荧光报告蛋白的mRNA表达量显著低于野生型斑马鱼。结论 Nde1基因缺失可能通过影响神经前体细胞分化和增加凋亡，导致三叉感觉神经元及脊髓神经元发育异常。

Abstract

Objective To investigate the effect of Nde1 gene knockout on early neural development of zebrafish by visualizing the development of neural networks in zebrafish. Methods Transgenic zebrafish Tg （Nde1^-/-； HuC：RFP^+/-） was constructed by crossing Nde1^-/- with Tg （HuC：RFP^+/-）. The HuC promoter was employed to drive the expression of red fluorescent protein in neurons， which allowing the visualization of zebrafish neural networks and tracking of neural development. Furthermore， by using Image J and Prism to compare the average fluorescence intensity of neurons and the expression level of fluorescent reporter proteins between Nde1 deficiency zebrafish and wild type zebrafish， the effect of Nde1 gene knockout on zebrafish neural development was analyzed. Results From 48 hours post-fertilization （hpf） to 7 days dpf， the average fluorescence intensity of red fluorescence expressed by trigeminal sensory neurons and spinal cord neurons in Nde1 deficiency zebrafish was lower than that in wild type zebrafish. RT-qPCR results also showed that the mRNA expression level of red fluorescent reporter protein in Nde1 deficiency zebrafish was significantly lower than that in the wild type zebrafish. Conclusion Nde1 gene deletion may lead to abnormal development of trigeminal sensory neurons and spinal cordneurons by affecting neural progenitor cell differentiation and increasing apoptosis.

Graphical abstract

关键词

Nde1 / HuC：RFP / 神经发育 / 斑马鱼

Key words

Nde1 / HuC： RFP / neurodevelopment / zebrafish

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刘婷,张琦,林佳,张颖蓝,李强. 利用HuC：RFP标记技术研究 Nde1 基因敲除斑马鱼的神经发育异常[J]. 复旦学报（医学版）, 2025, 52(06): 794-802 DOI:10.3969/j.issn.1672-8467.2025.06.003

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Nde1基因位于16p13.11内，参与微管组织形成及中枢神经系统发育的关键过程^［1-2］。Nde1的磷酸化在脊椎动物大脑发育中，尤其在神经祖细胞核迁移和神经元层次结构的调控中起着重要作用^［3］。敲除小鼠体内的Nde1基因会导致正在增殖中的神经祖细胞在3个不同的阶段发生细胞周期停滞，包括在顶端相互作用的核迁移期间、G2期到M期以及G1期到S期的过渡期间^［4］。临床研究表明，携带纯合NDE1基因移码突变的个体表现出显著的小头畸形和皮层脑回结构的严重简化，且突变导致的NDE1蛋白质不稳定，无法有效与细胞质动力蛋白结合，也不能正确定位到中心体^［5-7］。在前期研究中，本团队利用CRISPR/Cas9系统成功构建了Nde1基因敲除斑马鱼模型^［8］，并通过神经系统凋亡分析，发现Nde1基因敲除斑马鱼相较于野生型斑马鱼表现出显著增加的神经系统凋亡。

斑马鱼作为神经科学研究的重要模型，目前被广泛地应用于基因筛选^［9-10］，其胚胎在发育过程中的光学可见性使得研究者能够在不干扰其正常生理状态的前提下，对体内整个中枢神经系统进行高分辨率成像^［11-12］，并动态观察基因在神经发育过程中的作用。精准标记和追踪特定神经细胞及其轴突投射对神经科学研究至关重要。HuC是特异性地驱动神经元表达的启动子，已被广泛应用于斑马鱼神经元早期发育研究^［13-14］。该启动子具有高度的神经元特异性，能够有效驱动基因在神经元细胞表达。Tg （HuC： RFP^+/^-）转基因斑马鱼模型可在神经元中表达红色荧光蛋白，为直观观察神经元分布与形态提供了有力工具。

尽管已有研究探讨了Nde1基因在神经发育中的作用，但缺乏对基因缺失在神经网络形态发育过程中动态影响的研究。本研究创新性地构建了Tg （Nde1^-^/^-；HuC：RFP^+/^-）斑马鱼模型，利用HuC启动子特异性表达红色荧光蛋白，成功实现了对Nde1基因敲除斑马鱼大脑和脊髓神经元的可视化。该模型能够动态观察Nde1基因缺失对神经系统早期发育的影响，并可通过共聚焦激光显微镜技术，追踪神经发育过程中的形态变化，比较Nde1基因敲除与野生型斑马鱼的神经发育差异。这种动态、实时的观察方法为研究基因缺陷对神经系统发育的影响提供了新的视角，也为进一步了解Nde1基因在神经发育中的作用提供了重要依据。

材料和方法

实验动物本研究于2023年9月至2024年6月开展，所使用的Nde1基因纯合敲除斑马鱼Nde1^-^/^-由复旦大学附属儿科研究所转化中心实验室李强教授课题组利用CRISPR/Cas9系统构建，Tg （HuC：RFP^+/^-）斑马鱼由复旦大学附属肿瘤医院王旭教授馈赠。本研究中所使用的斑马鱼饲养于复旦大学附属儿科医院斑马鱼平台内，饲养水温恒定28.5 ℃，光照条件为每天14 h的光亮环境和10 h的黑暗环境交替（8：00 AM—22：00 PM，光亮环境）。斑马鱼卵在自然交配的条件下获得，刚产的斑马鱼卵前7天在胚胎培养液中孵育，间隔1天换1次胚胎培养液，第8天将斑马鱼卵转入缸中喂食草履虫到第14天，14天后的斑马鱼幼鱼喂丰年虫，1天2顿（10：00 AM，15：00 PM），斑马鱼饲养到3个月性成熟期后即可交配。后续使用共聚焦激光显微镜成像观察斑马鱼神经系统发育情况时，可在受精卵受精10 h后给予浓度为1.5%的1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU）处理，以抑制斑马鱼胚胎发育过程中黑色素的形成。

Tg （ Nde1^-^/^-； HuC：RFP^-^/^-）斑马鱼的获得首先将受精后3月龄（3 months post-fertilization，3 mpf）（已达到性成熟）的Nde1^-^/^-与Tg（HuC：RFP⁺^/^-）的斑马鱼进行侧交，获得的受精卵置于胚胎培养液中孵育，并在受精后10 h（10 hours post-fertilization，10 hpf）给予浓度为1.5%的PTU处理；在受精后48 h，在荧光显微镜观察下挑选出脑部和脊髓表达红色荧光的鱼卵继续养到直至性成熟。F1代斑马鱼基因型为Tg （Nde1⁺^/^-； HuC：RFP⁺^/^-）。将性成熟（3 mpf）Tg （Nde1⁺^/^-；HuC：RFP⁺^/^-）个体与Nde1^-^/^-个体进行侧交，所得受精卵置于胚胎培养液中孵育，并于48 hpf时，通过荧光显微镜观察，筛选出脑部和脊髓表达红色荧光蛋白的胚胎，继续培养至3 mpf，剪尾提取组织基因组DNA进行PCR基因型鉴定，并使用Snapgene软件对测序结果进行分析对比，挑选出Tg （Nde1^-^/^-；HuC：RFP⁺^/^-）斑马鱼用于后续实验。随后，将性成熟的Tg （Nde1^-^/^-；HuC：RFP⁺^/^-）个体再次与Nde1^-^/^-个体侧交，所得受精卵在含有浓度为1.5% PTU的胚胎培养液中孵育，并于48 hpf时，利用荧光显微镜筛选出脑部和脊髓中表达红色荧光蛋白的胚胎继续孵育，通过共聚焦显微镜对红色荧光蛋白标记的神经元进行动态追踪观察，记录其形态变化及发育情况。

仪器和耗材使用Leica 205C显微镜和Confocal TCS SP8显微镜（均购自德国Leica公司）。

荧光强度定量使用Image J确定神经元荧光蛋白的平均灰度级。选择感兴趣区域（area of interest，AOI），以确保神经元保持在AOI的边界内，并测量每个AOI的平均灰度级。

RT-qPCR

使用TRIzol试剂（Ambion，美国赛默飞公司）提取总RNA。使用PrimeScriptTM RT试剂盒（RR047A，TaKaRa，美国赛默飞公司）和miRNA第一链cDNA合成试剂盒（MR101-01，Vazyme，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），并储存于-20 ℃。在96孔PCR板（BioLabs，艾美捷科技有限公司）中，每个样品一式三份进行分析。不含cDNA的反应混合物用作阴性对照。引物β-actin-qPCR-F：5’-CGAG CTGTCTTCCCATCCA-3’，β-actin-qPCR-R：5’- TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3’；Nde1-qPCR-F：5’-GCAATCGGGAACTCCTTACA-3’，Nde1-qPCR-R：5’-TCTCTGCCAGGTCTCTTT CTA-3’，RFP-qPCR-F：5’-CATGAAGCTGTACA TGGAGGGCAC-3’，RFP-qPCR-R：5’-GACTGC TTAAAGAAGTCGGGGATG-3’。实验在CFX96仪器（美国BioRad公司）上进行。使用ΔCt方法计算和分析RNA水平。

统计学分析

所有数据使用GraphPad Prism 9.0分析处理，两组数据之间相比较采用非配对t检验（双侧），P<0.05为差异有统计学意义。

结果

构建转基因斑马鱼系，在 Nde1 缺陷斑马鱼中通过HuC：RFP标记神经元

本研究构建了Tg （Nde1^-^/^-；HuC：RFP^+/^-）斑马鱼系（图1A），以探究Nde1基因对斑马鱼早期神经系统发育的影响。在该模型中，Nde1缺陷斑马鱼神经系统中特异表达红色荧光蛋白（图1B），使得神经发育过程中三叉感觉神经元以及脊髓运动神经元可视化。此外通过测序筛选出TATG 4个碱基缺失的Nde1纯合敲除的斑马鱼Tg （Nde1^-^/^-；HuC：RFP^+/^-）（图1C）。经RT-qPCR分析发现，与对照组Tg （HuC：RFP^+/^-）相比，Tg （Nde1^-^/^-；HuC：RFP^+/^-）中Nde1的mRNA表达量显著减少（图1D）。上述结果表明，本研究成功构建了Tg （Nde1^-^/^-；HuC：RFP^+/^-）转基因斑马鱼，为进一步研究Nde1基因在神经系统发育中的作用奠定了基础。

体内可视化 Nde1 缺陷斑马鱼神经元核团在共聚焦激光显微镜下，我们获得了Nde1基因缺陷斑马鱼胚胎大脑和脊髓中表达红色荧光蛋白的神经元的高分辨率图像。在48 hpf时，表达红色荧光蛋白的神经元可通过其明亮的荧光和在大脑与脊髓中的位置（特别是三叉感觉神经元核团和脊髓神经元核团）进行清晰的识别（图2）。根据这些结果，可以评估被红色荧蛋白光标记的神经元的发育情况，分析Tg（Nde1^-^/^-；HuC：RFP⁺^/^-）在HuC启动子下表达神经元特异性的红色荧光蛋白，来探索Nde1基因缺陷是否会导致斑马鱼神经元发育不良。

在 Nde1 基因缺陷斑马鱼中三叉感觉神经元核团及脊髓神经元核团发育不良

Tg（Nde1^-^/^-；HuC：RFP⁺^/^-）是一个简单而有效的工具，可体现Nde1基因缺失导致斑马鱼神经发育过程中发生突变。总体来看，Nde1基因缺陷斑马鱼神经元发育不良在Tg（Nde1^-^/^-；HuC：RFP⁺^/^-）胚胎红色荧光标记的神经元中十分明显，与野生型胚胎相比，Nde1基因缺陷胚胎的神经元表现出较弱的红色荧光。三叉感觉神经元核团以及脊髓神经元核团表达较强烈的红色荧光蛋白，使得三叉感觉神经元核团和脊髓神经元核团在斑马鱼脑部和脊髓的神经元中比较容易识别，因此本研究重点关注这些神经元，并进行了荧光强度分析。

从48 hpf到受精后7天（7 days post-fertilization 7dpf），Nde1基因缺陷斑马鱼相比野生型斑马鱼，三叉感觉神经元核团平均荧光强度显著减少（图3，图4），脊髓神经元核团平均荧光强度也显著减少（图5，图6）。可见，在斑马鱼早期神经发育过程中，Nde1基因缺陷会导致三叉感觉神经元核团以及脊髓神经元核团发育不良。

与野生型胚胎相比，Nde1基因缺陷胚胎中的红色荧光蛋白报告基因的表达从48 hpf到7 dpf都显著降低（图7），这表明Nde1基因缺陷斑马鱼的神经发育发生了改变。

讨论

本研究通过构建具有红色荧光标记神经元的Nde1基因纯合敲除斑马鱼模型Tg （Nde1^-^/^-；HuC：RFP⁺^/^-），观察并分析了Nde1基因缺陷对神经发育过程的影响。研究结果表明，Nde1基因缺陷斑马鱼表现出明显的发育异常，尤其在大脑和脊髓中，三叉感觉神经元核团及脊髓神经元核团的红色荧光强度显著降低。这一现象与Nde1基因缺失突变体中观察到的神经发育障碍一致^［8］，提示Nde1基因在早起神经发育中扮演着至关重要的角色。

Nde1基因的突变导致神经前体细胞在DNA复制过程中产生与DNA复制相关的双链断裂，而Nde1基因介导的异染色质复制是神经元分化不可缺少的组成部分^［15-16］。研究表明，Nde1基因功能的缺失可能与基因组水平的神经系统疾病发生相关^［17］。在小鼠模型中，Nde1突变已被证实会引发DNA损伤，从而激活p53依赖的凋亡信号通路，并影响神经祖细胞的分化，导致大脑皮层畸形，表现为神经元数量减少及皮层结构变薄^［18］。人类NDE1基因的突变同样与显著的大脑皮层体积减少相关^［19］。此外，在Nde1基因缺陷斑马鱼中，包括大脑、中脑、菱形区和脊柱在内的神经系统显示出明显的凋亡增加^［8］。

通过高分辨率的共聚焦显微镜技术，本研究成功监测了从胚胎48 hpf 到7 dpf期间，Nde1基因缺陷斑马鱼的神经形态发育，并与野生型斑马鱼进行了动态比较。与传统侵入性实验方法相比，HuC启动子是斑马鱼神经元的有效早期标记物^［20-21］，利用HuC启动子特异性标记神经元的红色荧光表达，不仅能够清晰地观察和分析神经网络的形态变化，还能在动态发育过程中快速获取数据。

本研究还发现，Nde1基因缺陷的斑马鱼在神经元发育过程中表现出三叉神经元和脊髓神经元的发育异常，红色荧光强度的降低与其神经发育障碍的表现一致。

综上所述，本研究证实了Nde1基因在神经发育过程中扮演着关键角色，其缺失可能通过影响神经前体细胞的分化和增强凋亡过程，导致神经系统的发育异常。此外，HuC启动子标记的Tg（Nde1^-^/^-；HuC：RFP⁺^/^-）转基因斑马鱼模型为进一步研究Nde1基因缺陷对神经系统发育和神经网络形态的动态影响提供了有效工具。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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