基于脑瘫患儿的外显子组测序：TruSeq与NimbleGen试剂盒的捕获性能比较

Exome sequencing in children with cerebral palsy： a comparison of capture performance between TruSeq and NimbleGen kits

摘要

目的 比较TruSeq^® Exome与NimbleGen SeqCap EZ Human Exome两种外显子捕获试剂在脑瘫患儿中的捕获性能差异，为临床遗传学研究和诊断提供技术选择依据。 方法 纳入48例散发脑瘫患儿外周血样本，分别采用TruSeq（DNA探针）和NimbleGen（RNA探针）构建外显子组文库，经Illumina HiSeq 2000平台测序。通过生物信息学分析评估比对率、目标区域覆盖度、变异检出一致性等指标，并基于脑瘫相关基因集（2 293个基因）分析捕获性能的临床相关性，采用配对t检验进行统计学分析（显著性阈值α=0.05）。 结果 NimbleGen和TruSeq两种外显子组捕获试剂盒在基础数据质量（比对率、插入片段长度）和GC含量上差异无统计学意义。然而，在关键性能指标上呈现互补特征，NimbleGen在特定深度覆盖上表现更优（1×覆盖率，P=1.84×10^-5；20×覆盖率，P=1.49×10^-20）；而TruSeq则展现出更高的Indel检测灵敏度（TruSeq vs. NimbleGen：11 371±1 689 vs. 11 274±1 670，P=3.24×10^-7）和罕见变异捕获能力（TruSeq vs. NimbleGen：3 164±766 vs. 3 072±774，P=1.20×10^-4），并成功检出所有11个阳性致病变异（包括NimbleGen漏检的2例）。 结论 TruSeq凭借更优的变异检出率更适合临床诊断场景，而NimbleGen的覆盖稳定性可能有利于研究性项目。

Abstract

Objective To compare the capture performance differences between TruSeq^® Exome and NimbleGen SeqCap EZ Human Exome kits in children with cerebral palsy （CP）， and to provide a technical selection basis for clinical genetic research and diagnosis. Methods Peripheral blood samples from 48 sporadic CP patients were included. Exome libraries were constructed using TruSeq （DNA probes） and NimbleGen （RNA probes）， followed by sequencing on the Illumina HiSeq 2000 platform. Bioinformatics analysis was applied to evaluate mapping rate， target region coverage， variant concordance， and clinical relevance based on a CP-related gene set （2 293 genes）. The statistical analysis was performed using a paired t-test with a significance threshold of α=0.05. Results The results showed no significant differences between NimbleGen and TruSeq exome capture kits in basic data quality （alignment rate， insert size） and GC content. However， they exhibited complementary characteristics in key performance metrics： NimbleGen demonstrated superior performance in specific depth coverage （1×coverage rate，P=1.84×10^-5；20×coverage rate，P=1.49×10^-20）. TruSeq， on the other hand， showed higher sensitivity in Indel detection （TruSeq vs. NimbleGen：11 371±1 689 vs. 11 274±1 670，P=3.24×10^-7） and rare variant capture （TruSeq vs. NimbleGen：3 164±766 vs. 3 072±774， P=1.20×10^-4）， successfully identifying all 11 pathogenic variants （including 2 missed by NimbleGen）. Conclusion TruSeq， with its superior variant detection rate， is more suitable for clinical diagnostic applications， while NimbleGen’s coverage stability may be advantageous for research-oriented projects.

Graphical abstract

关键词

全外显子组测序（WES） / 捕获 / 试剂盒 / 脑瘫

Key words

whole exome sequencing （WES） / capture / kit / cerebral palsy

随着基因组学与生物信息学的迅猛发展，下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）已成为当代生物医学研究的核心工具之一^［1］。得益于NGS的广泛应用，每年约有250种单基因病的致病基因被成功鉴定。外显子是基因组中编码蛋白质的功能区域，尽管仅占整个基因组的1%~2%，却承载了约85%的已知孟德尔遗传病相关突变^［2］，并富集了大量与疾病易感性相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）^［3］。全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）作为NGS的重要分支，专注于分析生物体内外显子区域的DNA序列。目前，WES已广泛应用于遗传疾病诊断、致病基因鉴定、个性化医学以及基础研究，逐渐成为医学研究与临床诊断中不可或缺的重要工具^［4］。

然而，WES的检测性能高度依赖于外显子捕获探针的设计。不同技术（如DNA与RNA探针）在覆盖均一性、鸟嘌呤-胞嘧啶含量（guanine-cytosine content，GC）偏好性及边界捕获效率等方面存在差异^［5］，直接影响变异检出灵敏度与临床诊断率。目前虽已有研究比较不同平台的通用性能，但其结论多基于标准样本或全外显子整体指标，对于遗传异质性极高的复杂疾病，不同平台针对特定疾病相关基因集的捕获效能是否存在差异，尚缺乏系统研究。

脑性瘫痪（cerebral palsy，CP，后简称脑瘫）是成因复杂的非进行性运动障碍综合征，30%~40%的病例与遗传因素相关^［6］，其致病机制涉及高度异质性的基因结构变异和罕见的功能性突变^［7］。因此，选择灵敏度高的外显子捕获平台对于提高脑瘫的遗传诊断率至关重要。

本研究以48例散发性脑瘫患儿为研究对象，系统比较了两种主流外显子捕获试剂——TruSeq^® Exome（后简称TruSeq）与NimbleGen SeqCap EZ（后简称NimbleGen）的性能差异。通过评估两种平台在目标区域覆盖深度、变异检出一致性及脑瘫相关基因捕获效率方面的表现，为遗传异质性疾病的精准诊断提供技术支持与选择依据。

资 料 和 方 法

评估对象的选择 本研究共纳入48例未经筛选的散发性脑瘫患儿，均来源于郑州大学第三附属医院。所有病例的临床诊断由合作医院的专业临床医师完成，样本采集时间为2018年3月至2020年9月。每位入组患儿均由两名神经科医师独立确诊，围产期危险因素、运动功能（按照GMFCS分级）及共患病情况等信息通过标准化表格记录。本研究获得郑州大学医学伦理委员会批准（批件号：2016医伦审第69号），所有纳入患儿的监护人均签署了知情同意书。

外周血的采集、保存和DNA提取

采集每位患儿2 mL静脉血至EDTA抗凝管，于-80 ℃保存直至提取。采用QIAamp^® DNA Blood Mini Kit（德国Qiagen公司）提取基因组DNA，每次取220 μL全血（含血凝块样本经研磨预处理），洗脱体积80 μL。DNA浓度通过Qubit 4.0荧光定量仪（美国Thermo Fisher公司）检测，完整性经Agilent 4200 TapeStation评估（DNA Integrity Number≥7.0）。

片段化与末端修复 取2 μg DNA（浓度标准化至120 μL）经Bioruptor^® Plus超声破碎（循环参数：30 s ON/90 s OFF，15 cycles，4 ℃），获得150~250 bp片段。

双端建库 平行使用NEXTflex™ Rapid DNA-Seq Kit（德国Bioo Scientific公司）与NimbleGen SeqCap EZ Human Exome v3.0（瑞士Roche公司）构建文库，各试剂盒均按1 μg输入量操作。

文库质检 采用Agilent 2100 Bioanalyzer检测片段分布（合格标准：主峰180~220 bp），StepOnePlus™ Real-Time PCR System定量文库有效浓度（合格阈值≥2 nmol/L）。

液相杂交捕获 实验采用液相探针杂交捕获法对外显子组文库进行富集。对48个样本分别应用TruSeq Exome Kit（美国Illumina公司，DNA探针）与NimbleGen SeqCap EZ Human Exome v3.0（瑞士Roche公司，RNA探针）进行外显子捕获。捕获过程中均采用生物素标记的探针与链霉亲和素磁珠（Dynabeads MyOne Streptavidin T1，美国Thermo Fisher公司）进行结合。杂交条件：95 ℃变性5 min，65 ℃杂交16 h（杂交缓冲液：10% PEG-8000，5×SSC，0.1% SDS）。

高通量测序

文库质检合格后，于Illumina HiSeq 2000平台进行PE150测序。原始数据经以下质控过滤：（1）删除接头污染的读取（读取的原始碱基数量大于5 bp）；（2）去除低质量读数（原碱基数Q≤19超过总碱基的50%）；（3）去除不确定碱基（undetermined bases，Ns）含量>5%的读数。质控后获得的数据即为洁净数据。

vcf文件的产生

变异识别的分析步骤见图1。

生物信息学分析

首先进行序列比对和预处理，使用BWA-MEM （v0.7.17）将clean reads比对至GRCh37/hg19参考基因组；Picard （v2.27.4）进行排序、标记PCR重复（MarkDuplicates）及校正比对质量（FixMateInformation）；GATK （v3.8）完成局部重比对（IndelRealigner）和碱基质量校正（BaseRecalibrator）。针对变异检测与注释，SNP/Indel调用，GATK HaplotypeCaller生成gVCF，联合基因型分析（GenotypeGVCFs）；注释工具ANNOVAR（v2020-06-08）整合ClinVar（截至2024-04）、gnomAD v3.1及OMIM数据库（截至2024-04）；致病性预测PolyPhen-2（D得分≥0.95）、综合依赖注释缺失值（combined annotation dependent depletion，CADD）（Phred≥20）、MutationTaster（D/A置信）三重过滤（表1）。为确保公平比较，所有数据采用统一分析流程，保持一致过滤标准。

性能指标计算

比对率使用Picard Collect AlignmentSummaryMetrics （v2.27.4）统计有效比对reads比例；捕获效率使用Bedtools coverage （v2.30.0）计算目标区域覆盖度（≥10×定义为有效覆盖）；变异一致性使用BCFtools isec （v1.15.1）比对双试剂检出位点，计算Cohen’s kappa系数。

使用低覆盖度测序对样本进行基因分型。根据Xu等^［13］和Li等^［14］等的研究，低覆盖率测序可以成为大量样本进行疾病探索的有力工具。本研究采用低覆盖倍数进行全外测序的方法。

常见变异和罕见变异的定义

常见突变筛选标准为：测序深度Depth>10，支持变异型等位基因计数AlterAllele>5，基因型质量值（genotype quality，GQ）>60；稀有变异是在常见变异的基础上增加了群体频率f<0.01。

不同突变类型的筛选标准

在罕见变异的筛选基础上，对于剪接变异，要求位于经典剪接位点（±1/±2）且测序深度≥10，非经典位点需SpliceAI≥0.8。移码变异需长度1~50 bp，正负链支持均衡，排除同聚物区域。终止变异需导致蛋白截短≥10%且gnomAD东亚人群频率<0.1%。错义突变需通过PolyPhen-2、MutationTaster和CADD三重预测为有害，而同义突变需位于外显子核心区域。

CP基因集分析

基于文献^［15］构建脑瘫相关基因集（n=2 293），通过自定义Perl脚本统计以下指标：CP基因覆盖深度（depth of coverage，GATK）；致病位点捕获敏感性：真阳性（true positive，TP）/TP+假阴性（false negative，FN），以Sanger测序为金标准验。

变异预测

对于错义突变的致病性的预测，本实验利用Polymorphism Phenotyping v2 （PolyPhen-2）、CADD、和致病性预测算法Mutation Taster algorithms。仅保留经3次致病性评估预测为致病性的变异（Polyphen2：D、Mutation Taster：A/D和CADD>20）以供进一步分析。根据ACMG/AMP的标准^［16］将每个变异评估为致病性（pathogenic，P）、疑似致病性（likely pathogenic，LP）、不确定意义变异（variant of uncertain significance，VUS）、良性（benign，B）或可能良性（likely benign，LB）。当在已知的OMIM疾病基因中检测到P或LP变异，并且患者具有一致的该基因的临床表型时，就可以从遗传学上诊断个体。

统计学方法

本研究采用配对t检验进行统计分析。所有分析均基于R语言（版本4.3.1）实现，使用内置函数t.test（）进行检验。数据分析前通过Shapiro-Wilk检验验证数据正态性假设，并通过可视化方法（Q-Q图）确认配对差异的近似正态分布。统计显著性水平设定为双尾α=0.05。

结 果

质检结果

用Agilent 2100 Bioanalyzer检测查看文库片段大小是否合格。同时，通过StepOnePlus™ Real-Time PCR System检测后文库的浓度，检查是否符合上机测序要求。检查结果如补充图1所示，两个试剂盒的质检结果基本一致。

基础数据质量对比

实验在5个方面进行了详细对比：比对率、Q20、Q30、PCR重复率、插入片段中位数。结果显示，两种方法的比对率（TruSeq vs. NimbleGen：98.08%±0.46% vs.98.07%±0.46%）、Q20（TruSeq vs. NimbleGen：97.51%±0.19% vs.97.40%±0.20%）、Q30（TruSeq vs. NimbleGen：84.89%±10.56% vs. 84.54%±10.49%）、Q20/Q30比值（TruSeq vs. NimbleGen：1.17±0.18 vs.1.18±0.18）以及PCR重复率（TruSeq vs. NimbleGen： 0.38±0.01 vs. 0.39±0.01）均表现相似。在中位插入片段长度方面，TruSeq和NimbleGen分别为（252.31±13.96）bp和（252.50±13.97）bp，均符合短读长测序的标准范围（200~600 bp）。综合来看，两种建库方法在基础数据质量指标上具有高度一致性，均适用于后续分析。

捕获效率 两种方法的捕获率（Truseq vs. NimbleGen：88.79%±0.44% vs. 88.78%±0.44%，P=0.065）、80%覆盖均一性指标（Fold80，均为1.28±0.03，P=0.044）及GC含量（Truseq vs. NimbleGen：51.90%±0.09% vs. 51.91%±0.09%，P=0.084）差异均无统计学意义。但是1×覆盖（Truseq vs. NimbleGen：55.29±1.19 vs.55.31±1.19，P=1.84×10^-5）和20×覆盖（Truseq vs. NimbleGen：34.83±5.43 vs.34.91±5.42，P=1.49×10^-20）上，NimbleGen的数据均表现出优势（图2）。NimbleGen在特定深度下表现更优，在1×和20×覆盖深度下，NimbleGen的数据显示出极显著的统计学优势，可能因为NimbleGen的探针设计或捕获效率在低覆盖深度时更稳定，或对特定基因组区域的偏好性更低。

变异检出率相关性分析

本研究对48例患儿使用不同试剂盒的变异检出率进行了详细对比分析，平均测序深度基本一致［（Truseq vs. NimbleGen：（9.96±2.27）×vs. （10.00±2.28）×］，脑瘫基因的平均测序深度也基本一致［（Truseq vs. NimbleGen：（12.22±2.75）×vs. （12.26±2.76）×］，差异无统计学意义。通过比较两种试剂盒的检测结果，发现其在变异检出方面具有较高的一致性，一致率约为94%。

变异检测能力 在变异类型分析方面，TruSeq和NimbleGen的转换/颠换比值（TS/TV）分别为2.22±0.18和2.23±0.18（P=0.022），均处于外显子测序数据的预期范围内，表明两种方法均能有效保持变异的生物学特征。SNV检测数量显示，TruSeq略高于NimbleGen（79 362±7 590 vs. 79 251±7 596，P=0.001），而插入缺失（Indel）检测数量则呈现更显著的差异（Truseq vs. NimbleGen：11 371±1 689 vs. 11 274±1 670，P=3.24×10^-7）（图3A）。这些结果表明，虽然两种建库方法在SNV检测性能上相近，但TruSeq对Indel的检测灵敏度可能略具优势，这可能与其探针设计对结构变异区域的覆盖能力有关。综合来看，两种方法均适用于外显子组变异分析，但在研究涉及Indel的疾病时，TruSeq可能更为适合。

常见与罕见变异及基因捕获对比分析

NimbleGen在常见突变数（25 662±6 643 vs. 25 729±6 743）和常见突变基因数（10 313±1 578 vs. 10 338±1 651）上略高于Truseq，但差异无统计学意义。在罕见突变数方面，Truseq 的表现略优于 NimbleGen（Truseq vs. NimbleGen：3 164±766 vs. 3 072±774，P=1.2×10^-4），而在罕见突变基因数上，Truseq 同样略占优势（Truseq vs. NimbleGen：1 584±325 vs. 1 550±329，P=2.8×10^-4）。这些数据表明，两款试剂在常见突变的检测上表现相当，但在罕见突变的捕获上，Truseq 可能具有更高的敏感性。总体而言，两款试剂均能有效检测常见和罕见突变，且基因捕获效率相近。

功能变异类型对比

本研究对TruSeq和NimbleGen两种建库方法的功能性变异检测能力进行了深入比较。在剪接位点变异（splicing）检测方面，两种方法表现相当（Truseq vs. NimbleGen：107±20 vs. 106±19，P=0.425）（图3B）。然而，移码插入缺失（frameshift deletion/insertion）检测显示出显著差异（Truseq vs. NimbleGen：233±20 vs. 225±15，P=0.002），提示TruSeq可能对这类结构变异更为敏感。提前终止变异（stopgain）的检测数量在两组间无差异（均为132个）。非同义突变与同义突变比值（nonsynonymous/synonymous，SNV ratio）存在微小但显著的差异（Truseq vs. NimbleGen：0.954±0.027 vs. 0.953±0.026，P=0.025）。进一步分析显示，两种方法在单独的非同义突变（Truseq vs. NimbleGen：10 570±360 vs. 10 537±341，P=5×10^-4）和同义突变（Truseq vs. NimbleGen：11 078±305 vs. 11 064±307，P=0.027）检测数量上均存在统计学差异，但绝对差异较小（<1%）。这些结果表明，虽然两种建库方法对大多数功能变异类型的检测能力基本一致，但在移码变异和错义变异的检测灵敏度上存在细微但可重复的技术差异，TruSeq更显优势。

CP基因覆盖性能对比

实验采用了以往报道过的脑瘫相关的2 293个基因，并在这个基因列表中进行数据搜索。从统计结果来看，在脑瘫相关基因的捕获效率（CP基因reads数/总有效reads数）方面，TruSeq和NimbleGen无显著差异（14.49%±0.34% vs. 14.55%±0.33%，P=0.15）。在1×的脑瘫基因覆盖深度上无明显差异，均是61.28±1.06（P=0.067）；10×覆盖深度上，NimbleGen略优于TruSeq（78.01%±4.76% vs. 76.43%±5.61%，P=0.016）；20×覆盖深度上，NimbleGen明显优于TruSeq（30.80±5.62 vs. 30.72±5.59，P=1.93×10^-8）（图2）。这些结果表明，NimbleGen在CP基因的覆盖深度和一致性方面表现更优，尤其是在更高的20×覆盖率上。然而，两款试剂整体表现均较为优异，48个样本的覆盖率变异性较小。两款试剂均适用于CP基因测序，但NimbleGen在覆盖深度方面略胜一筹。

CP患者阳性变异的捕获对比

48例脑瘫患儿中有10例携带11个阳性变异的样本（表2），涵盖了不同基因的多种变异类型，包括2个剪接变异、4个终止变异、3个移码插入/缺失和2个错义变异。结果显示，Truseq和NimbleGen在大多数样本中均能成功捕获这些阳性变异。样本1（GDI1基因剪接突变）、样本4（HUWE1基因终止突变）、样本5（HIVEP2基因终止突变）、样本14（CTNNB1基因剪接突变）、样本19（NSD1基因终止突变）、样本15（TH基因错义突变和终止突变）、样本21（L1CAM基因移码插入突变）、样本35（B4GALNT1基因移码缺失突变）在两种试剂中均被检测到。然而，样本7（AUTS2基因长片段移码插入突变）和样本11（GJB1基因错义突变）仅在Truseq中检出，表明在某些特定变异类型上，Truseq可能具有更高的敏感性。这10个获得基因检测阳性的样本均为痉挛型脑瘫。所有变异均根据ACMG标准进行了致病性评估，并获得了相应的证据等级（如PVS1、PM2、PP3等）。这些结果说明，两款试剂在检测阳性变异方面均表现良好，但在某些特定情况下可能存在性能差异。未来可通过扩大样本量和增加变异类型，进一步验证两款试剂的捕获能力和一致性。

讨 论

本研究通过比较两种常用的外显子组DNA捕获试剂盒（TruSeq和 NimbleGen）在脑瘫患儿中的捕获性能，评估其在临床遗传学研究中的有效性与实用性。结果表明，两种试剂盒在捕获性能、覆盖率以及SNP检测方面具有较高的一致性，但在关键功能变异类型（如Indel、罕见突变）和CP基因覆盖深度上存在显著差异，为未来的遗传学研究和临床外显子测序的选择提供了重要参考。

在捕获性能方面，两种试剂盒均表现出良好的捕获效率（覆盖率88.8%，P=0.065）。TruSeq和NimbleGen在基础数据质量（如配对率、插入片段长度）上高度一致，但NimbleGen在特定深度覆盖上展现出优势（1×覆盖率，P=1.84×10^-5；20×覆盖率，P=1.49×10^-20）。这种差异可能源于其探针设计特性，但需要强调的是，在GC含量方面两组差异无显著统计学意义（P=0.084），不宜将覆盖深度优势归因于GC区域捕获效率。

在变异检测层面，两种技术呈现出明显的互补性。TruSeq对Indel缺失的检测灵敏度显著更高（P=3.24×10^-4），这可能与其探针梯度设计对低复杂度区域的更优覆盖相关^［17］，这一优势在Frameshift变异中尤为突出（P=0.002）。值得注意的是，TruSeq检出了10例患者的11个阳性致病变异（包括NimbleGen漏检的GJB1 c.C547T和AUTS2 p.G622Afs*43），且其罕见突变捕获数量显著占优（P=1.2×10^-4），表明其在临床诊断场景中更具敏感性。这种差异可能与TruSeq的DNA探针对外显子-内含子边界区域的更完整覆盖有关，而NimbleGen的RNA探针在±5 bp交界区存在轻微衰减（即“边缘效应”）^［5，18］，导致约6.3%的Splicing位点变异检测一致性损失（P=0.425）。

脑瘫是一种高度异质性的神经发育疾病，其病因复杂，涉及多种基因的相互作用。脑瘫的遗传异质性要求捕获技术选择需权衡覆盖深度与敏感性。脑瘫相关基因（如L1CAM、GDI1）常因大片段缺失/重复或复杂重排致病^［19-20］，而高深度覆盖是准确识别此类变异的前提。本研究发现NimbleGen对AUTS2和GJB1致病变异的漏检（样本7、11）具有重要临床启示。AUTS2变异（44 bp插入）的漏检可能导致神经发育障碍患者的分子诊断延迟，而GJB1（R183C）是Charcot-Marie-Tooth病的已知致病位点，其漏检可能影响遗传咨询。对于AUTS2 p.G622Afs43（44 bp复杂插入），NimbleGen漏检主要与以下机制相关：（1）片段长度效应。该变异位于AUTS2基因第12外显子（GC含量68.2%），其插入片段长度（44 bp）远超常规Indel检测阈值（<20 bp）。NimbleGen RNA探针的固定长度设计（80~95 mer）在杂交过程中可能因空间位阻导致变异区域探针结合效率下降^［17］，而TruSeq DNA探针的柔性连接臂（60~80 mer）更易容纳大片段变异，这种设计差异可能影响特定应用场景下的性能表现。（2）二级结构干扰。插入序列含连续9个CG重复，形成稳定的茎环结构（ΔG=-12.3 kcal/mol，预测工具mfold），可能阻碍RNA-DNA杂交体的形成^［21］。（3）覆盖波动性。尽管两组平均深度相近［（9.96±2.27）× vs. （10.00±2.28）×］，但该位点NimbleGen有效覆盖仅8×（支持reads=3），低于GATK HaplotypeCaller的最低检测要求（≥4 reads），而TruSeq达13×（支持reads=7）。对于GJB1 c.C547T变异（外显子2边界+3 bp），其漏检机制则体现不同的技术瓶颈：（1）探针边界效应。该位点位于NimbleGen探针设计边缘区（±10 bp），较TruSeq的±15 bp覆盖范围更窄^［22］，导致杂交效率衰减。（2）同源序列干扰。GJB1与假基因GJB2P1的高度同源（92%）引发NimbleGen长探针（80~95 mer）的交叉杂交，其错误比对率较TruSeq提升2.3倍。

值得注意的是，两种平台均未实现完美覆盖，存在各自的技术局限性（如高GC区、重复序列区）。这提示我们，技术选择应基于具体的临床或研究需求。对于疑似由特定类型变异（如已知的Indel致病位点）导致的病例，可优先选择灵敏度更高的平台；而对于病因不明、需进行全面筛查的病例，则应权衡覆盖均一性与变异灵敏度。未来技术的发展应致力于融合现有优势，如优化探针设计以同时提升覆盖均一性和复杂变异捕获能力。

尽管本研究提供了关于两种外显子组测序技术的详细比较，但仍存在一些局限性。首先，本研究样本量较小，仅包含48例脑瘫患儿，因此结果可能不具有广泛的适用性。未来的研究应扩大样本量，以进一步验证不同测序技术在更大范围内的表现。此外，虽然本研究着重于SNP的检测，但在脑瘫等复杂疾病的研究中，结构变异（如拷贝数变异）同样具有重要意义。因此，未来应探索捕获技术在检测结构变异方面的表现。

综上所述，本研究通过对NimbleGen和TruSeq两种外显子组测序技术的系统比较，为脑瘫的分子诊断和遗传研究提供了重要技术参考。综合分析表明，两种技术平台呈现出明显的互补特性：NimbleGen在特定深度覆盖上表现更稳定（P=1.93×10^-8），这种优势可能使其在需要高深度测序的研究场景中更具价值。而TruSeq则展现出更优的变异检测灵敏度，特别是在Indel（P=3.24×10^-7）和罕见突变（P=1.20×10^-4）的检出方面，结合其100%的阳性变异检出率，使其成为临床诊断的可靠选择。值得注意的是，两种技术在GC含量（P=0.084）和基础数据质量指标上高度一致，说明它们均能满足常规外显子测序的基本要求.

随着精准医学的发展，外显子测序技术的选择应当基于具体的临床需求和研究目标。本研究建立的性能比较框架，不仅适用于脑瘫的遗传分析，也可为其他神经发育障碍的分子诊断提供技术选择依据。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(32170615)