基于滚环扩增技术的外周血G-四链体检测方法的建立及其在 ATRX 突变型胶质瘤诊断中的应用研究

Establishment of a G-quadruplex detection method based on rolling circle amplification technology in peripheral blood and its clinical application in diagnosis of ATRX-mutant gliomas

摘要

目的 开发一种基于滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）技术的高灵敏度外周血G-四链体（guanine quadruplex，G4）检测方法，建立ATRX突变型脑胶质瘤的无创分子诊断体系，为临床早期筛查提供新型液体活检策略。 方法 采用shRNA慢病毒感染技术建立ATRX稳定敲低的原代脑胶质瘤细胞株（ATRX KD），通过硫黄素T（thioflavin T，ThT）荧光光谱法检测细胞上清液中G4的形成水平。构建ATRX敲低的原位脑胶质瘤小鼠模型，采用RCA变温扩增技术检测模型组与对照组外周血循环游离DNA（cfDNA）中G4的丰度，并对RCA变温扩增技术的程序进行优化。收集临床确诊的ATRX突变型和野生型胶质瘤患者，以及健康志愿者的血清样本，提取cfDNA后采用优化的RCA方案进行G4定量检测，并再次对检测程序进行优化。 结果 体外实验显示，ATRX敲低可显著促进G4结构的形成，ATRX KD组细胞上清液中ThT荧光强度较野生型显著增加。建立RCA变温扩增方案检测ATRX突变型胶质瘤小鼠模型外周血cfDNA中G4结构的实验条件：以50 ng cfDNA为起始模板、进行10个循环扩增。临床样本验证显示，优化后的RCA变温扩增方案较传统恒温扩增效率提升，能够有效区分ATRX突变型与野生型胶质瘤患者及健康人群。 结论 成功建立了基于RCA变温扩增的外周血G4高灵敏度检测方案，该技术首次实现ATRX突变状态的液体活检分子分型，为胶质瘤早期筛查提供具有临床应用前景的无创诊断方法。

Abstract

Objective To develop a highly sensitive method for detecting peripheral blood G-quadruplex （G4） based on rolling circle amplification （RCA） technology， establish a non-invasive molecular diagnostic system for ATRX-mutant gliomas， and provide a novel liquid biopsy strategy for clinical early screening. Methods ATRX knockdown glioma cell lines （ATRX KD） were constructed via shRNA lentiviral infection. Thioflavin T （ThT） fluorescence spectroscopy was employed to detect G4 levels in the supernatant. An orthotopic ATRX knockdown glioma mouse model was established. RCA was applied to compare G4 abundance in peripheral blood circulating cell-free DNA （cfDNA） between model and control groups， with optimization of RCA amplification protocols. Serum samples from clinically confirmed ATRX-mutant gliomas， wild-type gliomas， and healthy volunteers were collected. After cfDNA extraction， G4 quantification was performed using optimized RCA protocols with further procedural refinement. Results In vitro experiments demonstrated that ATRX knockdown significantly promoted the formation of G4 structures， with the ThT fluorescence intensity in the supernatant of ATRX KD cells being significantly higher than that in wild-type cells. The experimental conditions for detecting G4 structures in cfDNA from the peripheral blood of ATRX-mutant glioma mouse models using RCA temperature-variable amplification were established： starting with 50 ng of cfDNA as the template and performing 10 amplification cycles. Clinical sample validation showed that the optimized RCA temperature-variable amplification protocol improved efficiency compared to traditional isothermal amplification and effectively distinguished ATRX-mutant glioma patients from wild-type patients and healthy individuals. Conclusion This study successfully developed a highly sensitive peripheral blood G4 detection system based on RCA. This technology pioneers liquid biopsy-based molecular subtyping of ATRX mutation status， offering a clinically promising non-invasive diagnostic approach for early glioma screening.

Graphical abstract

关键词

ATRX基因突变 / 胶质瘤 / 循环游离DNA（cfDNA） / G-四链体（G4） / 滚环扩增（RCA） / 液体活检

Key words

ATRX gene mutation / glioma / circulating cell-free DNA （cfDNA） / G-quadruplex （G4） / rolling circle amplification （RCA） / liquid biopsy

脑胶质瘤年发病率约为6.4/10万人，是成人中枢神经系统发病率最高的原发性恶性肿瘤；分为Ⅰ~Ⅳ级，等级越高，恶性程度越高，总生存率越低，早诊断早治疗是赢得生存机会的关键^［1-2］。目前临床诊断金标准是MRI及CT影像学评估联合立体定向活检；MRI为诊断和评估治疗的首选，但其准确性只有80%~90%；病理学诊断虽可作为诊断依据，但组织活检存在并发症风险，尤其脑肿瘤生长位置特殊，更加难以实现治疗反应的动态监测^［3-5］。因此，开发新型无创诊断技术成为改善胶质瘤临床诊断及治疗的迫切需求。

ATRX基因位于X染色体q21.1区域，在中枢神经系统发育等方面发挥关键作用^［6-7］。ATRX突变在星形细胞瘤中高频发生，且与1p/19q共缺失存在互斥现象；ATRX突变与患者预后显著相关，可作为独立的预后评估指标^［8］，ATRX缺失还与微卫星不稳定性密切相关^［9-10］。目前临床上脑胶质瘤ATRX突变的检测主要有免疫组化、Sanger测序、下一代DNA测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS），Sanger测序是金标准，但通量低，且与NGS一样成本高；免疫组化操作简单、成本较低、但需要足量组织。

脑胶质瘤由于其生长部位特殊性，非手术活检/早筛取材难度远高于其他组织；且组织活检具有侵入性，有产生并发症的风险，组织活检受肿瘤异质性影响较大，难以重复取样以及定期检测。液体活检通过检测血液、脑脊液中的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）、循环肿瘤细胞或外泌体等标志物进行诊断，弥补了以上不足。其主要技术包括：（1）微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR），灵敏度高、可以绝对定量，但通量低、成本昂贵；（2）NGS，高通量、可检测未知突变，但试验操作复杂、成本高、分析复杂；（3）BEAMing技术，具有灵敏度高、绝对定量、特异性高的特点，但成本较高、操作复杂；（4）滚环扩增（rolling circle amplification，RCA），以环状寡核苷酸为模板，灵敏度高、特异性高，并且操作简便、经济高效，因而临床适用性强。

尽管液体活检技术在近些年有所发展，但ATRX突变型胶质瘤的无创分子诊断体系仍面临多重挑战。首先，血脑屏障严重阻碍脑肿瘤源性分子生物标志物的释放，导致血液中循环生物标志物浓度极低，这成为无创检测的主要障碍之一；其次，与其他肿瘤相比，胶质瘤患者的ctDNA比例显著较小，血浆中ctDNA检测率低于10%，远低于其他实体瘤（75%以上）；另外ATRX突变不同于点突变，常表现为大片段缺失或移码突变，这使得难以通过常规的ddPCR或NGS进行有效捕捉。综上所述，目前在ATRX突变型胶质瘤中，尚缺乏标准化、高灵敏度的无创分子诊断方案。

ATRX失活突变导致G4全局性累积，引发复制叉停滞及DNA损伤，游离DNA通过胞吐进入外周血。G4是Hoogsteen氢键形成G-四分体平面，经π-π堆积组装的特殊核酸二级结构，与肿瘤发生及细胞衰老等密切相关^［11-13］。RCA是一种基于phi29 DNA聚合酶的高效核酸扩增技术，通过环状DNA模板引导dNTP沿互补链延伸，生成大量串联重复的单链DNA产物，具有高保真性、高灵敏性及操作便捷性^［14-16］。

本研究旨在基于胶质瘤中ATRX基因突变与血液中G4含量的相关性，结合RCA技术，并利用G4与硫胺素T（thioflavin T，ThT）之间的特异性结合特性，建立一种无创检测ATRX突变型胶质瘤患者的新方法，以期为该类型胶质瘤的无创分子诊断与早期筛查提供新的策略。

资 料 和 方 法

研究对象 本研究符合人体试验伦理标准，经复旦大学附属华山医院伦理审查委员会批准［批件号：（2015）临审第（256）号］，研究对象知情且同意，本研究样本使用已获授权。入组标准：（1）经复旦大学附属华山医院神经肿瘤外科手术确诊为脑胶质瘤患者；（2）患者年龄、性别以及既往史以病历系统实际记载的为依据；（3）实施了规范的颅内肿瘤切除手术；（4）有完整术前术后评估资料；（5）有完整术前MRI图像。排除标准：术前影像资料考虑为脑胶质瘤但术后经病理证实为非脑胶质瘤的患者。研究共纳入24例样本，包括20例脑胶质瘤患者［其中高级别胶质瘤（high grade glioma，HGG） 10例，低级别胶质瘤（low-grade glioma，LGG） 10例；ATRX突变型11例，野生型9例］及4例健康志愿者为对照组。

研究方法人脑胶质瘤原代细胞分离培养

取新鲜肿瘤标本，置于无菌培养皿中；去除血凝块及电灼损伤组织；用预冷的HA培养液（H+GPSA medium）漂洗，剪碎，加入2 mL 0.1%胶原酶D及50 µL DNase I （100 U/mL），混匀，37 ℃、5% CO₂条件下消化30 min；300×g离心5 min，弃上清后加入2 mL Tryple Express，37 ℃孵育15 min；轻柔吹打至单细胞悬液，300×g离心5 min弃上清；加入5 mL红细胞裂解液，37 ℃孵育15 min后，加入等体积HA培养液终止反应；用100 µm细胞筛过滤去除未消化完全的组织块；收集细胞悬液，接种于T25培养瓶，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。细胞培养基为Neurobasal Medium+10% FBS+1%青霉素/链霉素。

构建ATRX KD人脑胶质瘤稳转株

将ATRX野生型人脑胶质瘤细胞，提前12 h铺板；加入ATRX shRNA/对照shRNA（shCon：5’-ATCTCG CTTGGGCGAGAGTAAG-3’；5’-shATRX：GG AACTAGCTCTTCAGAAA-3’）慢病毒液，37 ℃、5% CO₂孵育24 h；重复1次；弃上清，加入完全培养基，抗生素筛选5~7天，至对照组全部死亡；分离单克隆细胞株，通过Western blot验证基因表型。

细胞上清ThT荧光检测

将ThT与Tris-HCl-KCl溶液配成3 µmol/L的ThT工作液；将细胞上清与ThT工作液1∶1体积比混匀，室温避光孵育20 min；激发波长425 nm，发射波长490 nm，检测荧光值。

构建胶质瘤动物模型

提前48 h备皮；收集GL261细胞，调整细胞悬液密度至5×10⁵ 个/µL，置于冰上备用；将C57BL/6小鼠用异氟烷麻醉，并固定于瑞沃德脑立体定位仪上；用70%酒精消毒小鼠头部后，持手术刀切开小鼠头部皮肤，以前囟为坐标原点，在左2 mm、下3 mm处钻孔4 mm，等待2 min后上提1 mm，缓慢注射3 µL细胞悬液，注射完毕后静置5 min，缓慢向上旋出并用过氧化氢棉签擦拭消毒；用组织粘合胶粘合小鼠皮肤伤口，然后将其置于红外取暖灯下至苏醒后，放回原笼。

提取血清中的循环游离DNA（cfDNA）

使用QIAGEN循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）提取试剂盒，依据说明书取适量血清加入磁珠悬液，孵育后，加入微球洗脱液孵育，后经QIAmp UCP MiniElute柱吸附，EB缓冲液洗脱，得cfDNA并测浓度。

cfDNA环化连接反应 反应体系：50 ng/5 ng cfDNA，2 µL 10×T4连接酶缓冲液，1 µL T4 DNA连接酶（400 U/µL），无核酸酶水补足至20 µL。室温避光孵育2 h，65 °C 10 min灭活。

RCA恒温扩增

配置36.5 µL反应体系：20 µL T4连接酶产物，3 µL 10×phi29缓冲液，2 µL 10 mmol/L dNTP，10 µL Random Hexamer （50 µmol/L），1.5 µL Equi-phi29 DNA聚合酶（10 U/µL）；30 ℃恒温水浴12 h，随后立即将反应管65 ℃加热10 min以灭活phi29 DNA聚合酶，终止反应。

RCA变温扩增

配制35 µL预混体系：20 µL T4 DNA连接酶产物，3 µL 10×phi29缓冲液，2 µL 10 mmol/L dNTP，10 µL Random Hexamer （50 µmol/L）；95 ℃ 3 min，25 ℃ 3 min；向退火产物中加入1.5 µL Equi-phi29 DNA聚合酶（10 U/µL），混匀后10 000×g离心10 s；然后将反应管置于PCR仪中运行循环扩增程序：30 ℃ 5 min，42 ℃ 15 s，循环10次；取产物1/10体积重复进行T4连接酶连接成环，进行前四步实验步骤；将前五步实验步骤重复4次；扩增循环5次，得到第五次PCR终产物，并采用乙醇沉淀法回收并纯化。

统计学分析

使用 GraphPad Prism 6软件进行统计分析，采用了独立样本t检验和单因素方差分析不同组之间的显著差异，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

体内外 ATRX 突变型/野生型中G4含量的差异分析

为了验证胶质瘤中ATRX的基因状态对G4表达水平的影响，我们采用手术切除的新鲜胶质母细胞瘤标本（病例1）分离原代细胞培养，该标本经病理鉴定为WHO Ⅳ级、IDH野生型（-）且ATRX野生型（+）（图1A~C）。成功分离的脑胶质瘤原代细胞在体外培养中表现出良好的增殖活性，呈现典型的肿瘤干细胞生长特性：细胞呈立体球形及圆形，以悬浮方式生长（图1D）。培养约72 h后即可观察到特征性神经球结构的形成（图1E）。

利用慢病毒转染技术在ATRX野生型人脑胶质瘤细胞中构建ATRX敲低稳转株（图1F、1I）。该稳转株在体外培养中保持良好的增殖活性，呈现典型的肿瘤干细胞生长特征：细胞呈立体圆形或球形，以悬浮方式生长，并能形成特征性的三维神经球结构（图1G、1H）。

分别收集ATRX野生型（ATRX WT）和ATRX敲低（ATRX KD）的人脑胶质瘤细胞培养上清液。RCA恒温扩增后，与ThT在室温下孵育结合，通过检测荧光强度比较两组细胞上清中G4含量的差异。此外，我们还对比分析了富含鸟嘌呤序列的DNA与ThT的结合情况。

低细胞密度（5×10⁵）培养上清与ThT孵育检测结果显示，ATRX敲低组与野生型组的荧光强度无显著差异（图2A）。当细胞密度增加至1×10⁶时，ATRX敲低组上清与ThT结合后的荧光强度显著高于野生型组（图2B，P=0.007）。

这一结果提示，ATRX KD组与ATRX WT组细胞上清中G4含量差异显著，证实了ATRX基因表达对G4形成的影响。

除了体外实验，我们亦采用RCA变温扩增技术动态监测了小鼠成瘤过程中1周内的G4丰度变化。结果证实了ATRX基因突变的脑胶质瘤小鼠在体内确实会产生更多的G4结构，为利用外周血G4水平作为无创性肿瘤标志物提供了重要依据。

基于 ATRX 突变脑胶质瘤动物模型的RCA扩增条件的优化

通过建立ATRX敲低（KD）的GL261小鼠胶质瘤稳转株（GL261-shATRX），构建ATRX KD和ATRX WT脑胶质瘤小鼠模型。结合组织解剖及HE染色验证肿瘤形成（图3）。

为优化RCA技术对G4四链体结构的检测效率，本研究首先建立了基于温度梯度优化的变温扩增体系。以50 ng血浆cfDNA为模板（样本来源包括ATRX KD、ATRX WT胶质瘤小鼠模型及健康对照小鼠），所有样本经T4 DNA连接酶环化处理后，在phi29 DNA聚合酶催化下，分别进行5、10、20个循环的RCA扩增。扩增产物与ThT孵育后，使用酶标仪检测G4信号强度。

结果显示，5个循环组与20个循环组的G4信号强度组间差异无统计学意义（图4A），推测是在20个循环组中，扩增反应已经到达平台期，因此健康小鼠对照组和ATRX WT组中检测所得信号过高，各组之间差异无统计学意义。值得注意的是，在10个循环条件下，ATRX KD组的G4信号强度较健康小鼠对照组显著升高（P=0.035），而与ATRX WT组相比无显著差异（P=0.065）；同时，ATRX WT组与健康小鼠对照组的G4水平基本一致。这些数据表明，10个RCA循环可在50 ng cfDNA起始量的条件下实现最佳的G4扩增效率，并有效区分ATRX基因的突变状态（图4A）。

为进一步优化RCA变温扩增G4的检测灵敏度，我们分别以5 ng和50 ng cfDNA为起始量，比较5个和10个循环的RCA扩增效果。结果显示，以5 ng cfDNA为起始量时，经过5个和10个循环，ATRX KD与健康小鼠对照组之间均未观察到显著差异（图4B）。以50 ng cfDNA为起始量时，5个循环条件下，ATRX KD组与WT组和健康小鼠对照组均无显著差异（P=0.059，P=0.062）；而10个循环条件下，ATRX KD组的G4信号强度显著高于WT组及健康小鼠对照组（P=0.013，P=0.008）（图4C）。

优化RCA条件后，我们以健康人外周血、ATRX突变的胶质瘤患者外周血为样本进行检测，以验证RCA检测灵敏度，结果显示，以50 ng cfDNA为起始量，在10个循环条件下，ATRX突变组与健康志愿者对照组、阳性对照组均有显著性差异（图4D），一定程度上证明了RCA扩增的高灵敏度。

胶质瘤患者血清中G4四链体结构的检测分析

为评估RCA变温扩增技术在临床诊断中的应用价值，并优化G4四链体结构的检测方法，采用临床脑胶质瘤患者外周血血清标本进行验证。

首先从血清标本中提取cfDNA，通过PCR初步扩增G4结构。然而，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增条带信号较弱。为提升检测灵敏度，我们分别采用RCA恒温扩增和变温扩增技术进行对比分析。结果显示，RCA恒温扩增后，ATRX突变型胶质瘤患者较健康志愿者对照组cfDNA的荧光信号无显著差异（P=0.076，图5A）。RCA变温扩增后，ATRX突变型患者的G4结构丰度明显高于健康志愿者对照组，两组间荧光强度差异具有统计学意义（P=0.029，P=0.008，图5B）。这一发现提示，RCA变温扩增技术可显著提升G4四链体结构的检测灵敏度。值得注意的是，ATRX突变可能与G4结构的形成存在潜在关联，为胶质瘤的分子诊断提供了新的研究方向。

随后，我们对RCA的变温扩增条件进行了系统优化，具体实验流程如图6所示。在优化后的反应体系中，RCA变温扩增流程中进行了10个PCR循环。结果显示，所有ATRX突变型脑胶质瘤患者的血清标本与健康志愿者对照组的血清标本的差异均有统计学意义（P<0.05），而ATRX野生型脑胶质瘤患者血清标本与健康志愿者对照组之间则未观察到统计学差异（图7）。这一发现与动物实验结果完成一致。

通过本研究，我们成功建立并优化了扩增G4结构的扩增实验体系，其最佳反应条件为：以50 ng cfDNA起始模板，经T4 DNA连接酶环化后，进行RCA变温扩增。PCR条件：95 ℃ 预变性3 min，25 ℃退火3 min；随后加入Equi-phi29 DNA聚合酶（10 U/μL）进行扩增反应：30 ℃延伸5 min，42 ℃变性15 s，共循环10次。

讨 论

本研究通过多维度实验体系系统性地阐明了ATRX基因表达对脑胶质瘤中G4含量的影响，并建立了一套RCA检测方法。研究首先在体外细胞实验中，采用慢病毒感染构建ATRX基因敲低稳转株，Western blot验证敲除效率后，创新性地采用RCA变温扩增技术，与恒温扩增方法相比，其G4扩增效率显著提高。RCA恒温扩增无法检出ATRX基因敲低引起的G4丰度变化，而RCA变温扩增技术发现ATRX基因敲低可显著提升细胞上清液G4的丰度。在体内实验中，通过系统优化实验条件，确定以50 ng cfDNA作为起始模板，10个循环为最佳扩增条件。该优化方案在ATRX突变型、野生型胶质瘤及健康对照小鼠样本中展现出最佳的G4分辨能力，显著优于传统恒温扩增方法。此优化方法不仅提高检测效率，还更准确呈现ATRX突变、ATRX野生型脑胶质瘤患者及健康志愿者血清标本中G4含量的差异，为脑胶质瘤的早期诊断、治疗方案制定及病情监测提供有力技术支持。

分子机制研究表明，ATRX作为染色质重塑蛋白，通过其ADD结构域和解旋酶结构域特异性识别G4结构^［6，17］。最新WHO中枢神经系统肿瘤分类（2021版）强调，包括ATRX基因突变在内的分子标志物对胶质瘤分型具有重要临床价值^［18-20］。我们的研究发现，ATRX突变导致肿瘤细胞有丝分裂过程中G4结构异常累积，并通过细胞外分泌途径进入外周循环系统。我们在胶质瘤原代细胞中观察到，胶质瘤ATRX敲低后，细胞上清液中G4的表达增加（图2）。这一发现为理解ATRX突变在胶质瘤发生发展中的作用提供了新的分子机制解释。

1948年，cfDNA首次在癌症患者血清中发现，为一种新型的生物标志物，是细胞外部分降解的DNA小片段。cfDNA分子检测现已广泛用于肿瘤检测^［21］、器官移植、产检等部分领域。cfDNA主要来源于基因组DNA以及线粒体DNA，以裸露核酸的形式存在于外周血循环中^［22-23］。本研究通过提取血清中的cfDNA，并进行G4检测，为胶质瘤的早期液体活检提供了可能。

本研究对RCA技术进行了全面的优化。RCA技术利用phi29 DNA聚合酶的高效链置换活性，可实现短片段DNA/RNA的指数级扩增，其产物为包含数百个重复单元的单链DNA长链^［24-26］。通过对多种检测方法（包括胶体金法、电化学法、量子点法等）的系统比较，单链特异性荧光标记法具有最优的信噪比和检测灵敏度，被选定为检测方案。特别值得关注的是ThT荧光标记技术的应用，该分子通过苄胺环和苯硫醚环的自由旋转维持低背景荧光，当其与G4特异性结合后，分子构象固定导致荧光强度显著增强^［27-29］。本研究通过系统优化RCA变温扩增的起始模板和PCR循环次数，建立了优化的G4检测流程。实验数据表明，优化后的RCA技术在ATRX突变型胶质瘤患者血清检测中的准确率达100%（n=8），且ATRX突变型胶质瘤患者血清cfDNA中G4的表达量显著高于健康志愿者。

从临床转化和应用前景来看，本研究具有重要的实践价值。cfDNA中的G4作为新型液体活检标志物，其检测避免了传统组织活检的创伤性，且能反映肿瘤异质性。本研究证实，在动物模型动态监测中发现，ATRX突变型胶质瘤小鼠外周血G4水平从接种后第3天即呈现持续升高趋势，而野生型组在整个观察期内未表现显著变化，这一特征为疾病早期诊断提供了潜在的时间窗口。

综上所述，本研究揭示了ATRX突变脑胶质瘤患者癌细胞中G4可能通过多种机制释放至细胞外并进入外周血进而使血清中可检测到的G4增多。基于这一发现，我们最终成功建立并优化了滚环扩增技术，提高了G4的扩增效率。我们进一步利用可与G4特异性结合的荧光物质ThT，实现了对G4的精准标记与检测。临床上对ATRX突变脑胶质瘤的鉴定主要依赖于患者的主诉及影像学检查，而基因型鉴定的步骤相对繁琐。因此，本研究建立的优化RCA检测外周血G4方法，为脑胶质瘤的早期诊断和精准分型提供了可靠的技术方法，有望成为一种快速、有效的脑胶质瘤早期筛查及ATRX突变脑胶质瘤鉴别的手段。

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