邻近标记技术对活体小鼠耳蜗毛细胞表面蛋白进行特异性标记

摘要

目的 开发标记小鼠耳蜗毛细胞的细胞表面蛋白的方法，为测定耳蜗毛细胞表面蛋白质组提供依据。方法 构建在毛细胞中特异性表达一种辣根过氧化物酶融合蛋白(HRP fused with a transmembrane domain,HRP-TM )的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV),HRP-TM可以定位到毛细胞膜的外表面。通过显微注射将病毒注射到2 d新生C57BL/6小鼠的后半规管中，30 d时检测听觉脑干反应(auditory brainstem response,ABR)，并通过基底膜免疫荧光染色检测耳蜗中HRP表达和蛋白标记情况。结果 ABR结果显示，注射病毒的小鼠和未注射病毒的对照小鼠相比，听力无明显差异。基底膜免疫荧光染色结果显示，HRP-TM在毛细胞中特异性表达，内毛细胞的病毒感染效率超过95%，外毛细胞的病毒感染效率达到80%左右。而且，毛细胞的形态和排列与对照相比无明显差异。用荧光偶联链霉亲和素进行免疫荧光染色，只有表达HRP-TM的毛细胞的细胞膜表面有明显荧光信号。结论 本研究中构建的r AAV病毒可以高效特异性的标记耳蜗毛细胞的细胞表面蛋白，并且无明显的细胞毒性，不影响毛细胞的正常生理功能，为下一步分离耳蜗毛细胞的细胞表面蛋白并进行质谱分析奠定了基础。

关键词

耳蜗毛细胞 / 邻近标记 / 重组腺相关病毒 / 辣根过氧化物酶 / 细胞表面蛋白质组