黑果枸杞LrMYB64基因克隆及功能研究

Cloning and Functional Study of the LrMYB64 Gene in Lyciumruthenicum

摘要

黑果枸杞（Lyciumruthenicum）是我国西北地区特色的药食同源植物，果实富含花青素，具有极高的药用价值。为了解析黑果枸杞花青素合成的关键调控因子，该研究以黑果枸杞为材料，结合前期转录组分析克隆出候选基因LrMYB64，构建过表达载体并通过本源转化获得转基因枸杞，结合转录组测序解析其分子调控网络。结果表明：黑果枸杞中LrMYB64基因过表达，显著抑制花青素合成通路的关键结构基因（LrCHS1B、LrCHS2、LrF3H、LrDFR、LrANS、LrA3GT等）的表达，使植株花青素水平降低约91.75%，显著激活多个激素信号转导相关基因（LrPR4、LrPP2C51、LrSAUR36、LrGH3.6、LrARF5、LrABF4等）的表达，腋芽萌发数量提高至野生型的 3倍。综上，该研究初步证实LrMYB64基因通过负向调控花青素合成通路和正向调控激素信号转导通路，形成 1个以其为核心的基因调控网络，从而协同调控植物的次生代谢与激素响应过程。

Abstract

Lyciumruthenicum， a characteristic food-medicine plant in northwestern China， accumulates abundant anthocyanins in its fruits and possesses high pharmaceutical value. In order to identify the key regulators of anthocyanin biosynthesis and to clarify their coupled effects on lateral-bud development， the candidate gene LrMYB64 was cloned， an overexpression vector was constructed and transformed into L. ruthenicum， and the underlying molecular network was explored using transcriptome sequencing. The results showed that overexpression of LrMYB64 gene in L. ruthenicum significantly suppressed the expression of key structural genes in the anthocyanin biosynthetic pathway-including LrCHS1B， LrCHS2， LrF3H， LrDFR， LrANS， and LrA3GT-leading to the reduction by 91.75% in anthocyanin level. Meanwhile， it markedly upregulated multiple hormone-signaling genes such as LrPR4， LrPP2C51， LrSAUR36， LrGH3.6， LrARF5， and LrABF4， increasing lateral bud outgrowth to approximately three times that of the wild type. Together， these findings indicated that LrMYB64 gene orchestrated a gene regulatory network through which it repressed anthocyanin biosynthesis while promoting hormone signal transduction， thereby coordinating plant secondary metabolism and hormonal responses.

Graphical abstract

关键词

黑果枸杞 / LrMYB64基因 / 花青素 / 腋芽 / 转录组测序 / 功能分析

Key words

Lyciumruthenicum / LrMYB64 gene / anthocyanin / lateral bud / transcriptome sequencing / functional analysis

花青素是植物体内一类重要的水溶性类黄酮化合物，在果实着色、抗氧化、逆境抵御及吸引传粉媒介等方面发挥关键作用^［1-2］。其生物合成途径在多种植物中已得到系统解析，主要涉及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合酶（CHS）^［3］、查尔酮异构酶（CHI）^［4］、黄烷酮3-羟化酶（F3H）^［5］、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）^［6］、花青素合酶（ANS）^［7］及UDP-葡萄糖：类黄酮3-氧-糖基转移酶（UFGT）^［8］等一系列结构酶（图1）的催化^［9-10］。合成后的花青素需依赖谷胱甘肽S-转移酶（GST）、多药耐药相关蛋白（MRP）等转运蛋白的介导，最终储存于液泡中^［11-13］。

花青素合成途径的精准调控主要依赖于MYB（myeloblastosis-related transcription factor）、bHLH（basic Helix-Loop-Helix）和WD40（WD40-repeat protein）等转录因子形成的复合体（MYB-bHLH-WD40，MBW）^［14-15］。其中，MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一^［16-17］，而R2R3-MYB亚家族在调控次生代谢、发育进程及逆境响应中功能尤为突出^［18-21］。研究^［18］表明，多个R2R3-MYB成员是花青素合成的关键调控因子，如玉米（Zea mays）MYBC1^［22］、葡萄（Vitis vinifera）VvMYB5^［23］、苹果（Malus domestica）MdMYB10^［24］、茄子（Solanum melongena）SmMYB5^［25］、菊花（Chrysanthemum morifolium）CmMYB012^［26］等，均能通过直接结合或与bHLH蛋白互作，激活下游CHS、DFR、ANS等结构基因的表达，从而促进花青素积累。部分R2R3-MYB转录因子具有多效性，除调控代谢途径外，也广泛参与生长发育的调控，如小麦（Triticum aestivum）TaMYB305基因影响育性^［27］、CsMYB36基因参与黄瓜（Cucumis sativus）果实形态建成^［28］、CmMYB8基因降低菊花木质素含量^［29］等。因此，在特定物种中挖掘并鉴定关键的R2R3-MYB基因，对于解析花青素积累与复杂性状的调控网络具有重要意义。

黑果枸杞（Lyciumruthenicum）是我国西北地区特色的药食同源植物，其成熟果实因富含花青素而呈现独特的紫黑色，具有较高的营养保健价值与开发潜力^［30-31］。然而，目前对黑果枸杞花青素超高积累的分子调控机制，尤其是关键转录因子的功能认知仍十分有限。本课题组基于果实发育不同阶段转录组数据分析发现，随着花青素的快速积累，一个R2R3-MYB基因LrMYB64的表达呈现下降趋势，这为研究黑果枸杞中花青素合成机制提供新的研究线索。

尽管已有研究探讨了MYB转录因子在模式植物中的功能，但针对黑果枸杞中LrMYB64基因的生物学作用及其对花青素合成与植株发育的调控机制仍缺乏系统验证。基于此，本研究以黑果枸杞为材料，克隆LrMYB64基因，通过生物信息学分析与亚细胞定位明确其基本特征；构建过表达载体，在黑果枸杞中进行同源遗传转化，系统研究其对花青素合成及植株生长发育的调控功能；结合RNA-seq技术，阐明其下游调控网络。研究结果将为进一步揭示黑果枸杞果实着色与形态建成的协同调控机制提供理论依据，并为枸杞品质与性状的协同改良提供有价值的候选基因资源。

1 材料与方法

1.1　试验材料

本研究的黑果枸杞组培苗均由种子萌发获得。亚细胞定位所用本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种植于人工气候室（22℃、16 h光照/8 h黑暗）。

黑果枸杞分化固体培养基A：4.43 g·L^-1 MS培养基、30 g·L^-1蔗糖、6 g·L^-1琼脂、0.3 mg·L^-1 6-BA、0.5 mg·L^-1 NAA，NaOH调节pH至5.8~6.0。

黑果枸杞分化固体培养基B：4.43 g·L^-1 MS培养基、30 g·L^-1蔗糖、6 g·L^-1琼脂、0.5 mg·L^-1 KT、0.1 mg·L^-1 6-BA、0.1 mg·L^-1 NAA、30 mg·L^-1 Kan，NaOH调节pH至5.8~6.0。

黑果枸杞种子生根固体培养基：2.74 g·L^-1 1/2 MS培养基、30 g·L^-1蔗糖、6 g·L^-1琼脂，NaOH调节pH至5.8~6.0。

黑果枸杞扦插筛选固体培养基：2.74 g·L^-1蔗糖、30 g·L^-1 1/2 MS培养基、6 g·L^-1琼脂、1 mg·L^-1 IBA、30 mg·L^-1 Kan，NaOH调节pH至5.8~6.0。

1.2　植物材料与生长条件

从宁夏枸杞种质资源圃（38°38'50.54″N，106°9'30.65″E）采集的黑果枸杞种子，经流水冲洗30 min后，置于75%乙醇中消毒处理1 min。70%次氯酸钠轻轻混合消毒9 min后无菌水清洗4次；将这些种子接种于MS生根培养基中。幼苗长至5~6 cm，切取1 cm带有腋芽的茎段，并移至生根培养基中，置于光周期为16 h光照/8 h黑暗、环境温度为（24±1） ℃的组培室中无菌培养。

1.3　 RNA提取和cDNA合成

于-80 ℃存储的黑果枸杞样本中取适量的茎、叶组织置于液氮中，使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生物科技有限公司，中国）提取RNA。取适量液氮研磨的植物组织，加入裂解液后充分匀浆，离心后取上清，经乙醇调节结合条件并转移至吸附柱。依次使用去蛋白液和漂洗液进行柱清洗，其间在柱上进行DNaseⅠ消化以去除基因组DNA污染；用RNase-Free ddH₂O洗脱得到总RNA，产物于-80 ℃保存备用。以上述提取的RNA为模板，利用 PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒（宝日医生物技术有限公司，中国）进行单链cDNA合成。将反转录得到的cDNA溶液于-20 ℃保存备用。

1.4　黑果枸杞 LrMYB64 基因克隆

基于黑果枸杞基因组序列，运用在线网站primer 3 plus软件设计LrMYB64全长克隆引物（表1）。选取黑果枸杞cDNA作为反应模板，并成功扩增克隆黑果枸杞LrMYB64基因的正确序列。具体反应体系和程序如表2~3所示。

扩增产物经1%质量浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，UVP凝胶成像系统（AIpheImeger HP System，美国）拍照。将胶回收纯化的PCR产物连接至5 min TA/Blunt-Zero Cloning T载体后转化大肠杆菌（Escherichia coli）Top10感受态。选择经PCR验证的阳性克隆菌液送测序。

1.5　 LrMYB64 植物转化载体构建

植物表达载体采用本实验室保存的双元载体pBI121-eGFP。为将LrMYB64基因从T-载体转移至pBI121-eGFP，设计带同源臂的引物，以T-质粒为模板进行高保真PCR，胶回收纯化获得插入片段。同时，用XmaⅠ/SmaⅠ双酶切（宝日医生物技术有限公司，中国）线性化pBI121-eGFP（37 ℃，3~4 h），胶回收后NanoDrop 2000测定浓度。插入片段与线性化载体按3∶1摩尔比混合，使用ABclonal生物科技有限公司的MultiF Seamless Assembly Mix无缝克隆连接酶50 ℃反应20 min完成无缝连接。连接产物转化Top10大肠杆菌，涂布Kan 50 mg·L^-1 LB平板，37 ℃倒置培养12~16 h，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，选择测序结果正确的菌液提取重组载体质粒35S：：LrMYB64，转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101感受态。

1.6　获得 LrMYB64 转基因黑果枸杞

采用农杆菌介导的叶盘法，采集黑果枸杞无菌苗中部叶片，去除叶尖和叶基后置于黑果枸杞分化固体培养基中预培养2~3 d。随后将叶片浸入重悬的农杆菌菌液中侵染10~15 min，用无菌滤纸吸干后放回培养基进行暗培养2~3 d。之后，将叶片转移至黑果枸杞分化固体筛选培养基中，于正常光周期下培养，并每隔7~20 d更换1次培养基。待抗性芽生长至2~3 cm时，剪下并转入黑果枸杞扦插筛选固体培养基中，最终通过PCR鉴定与eGFP观测筛选获得转基因植株。

1.7　 LrMYB64 转基因黑果枸杞花青素含量测定

试剂：提取液（60%乙醇提取液）、试剂一（11%盐酸）和试剂二（4%香草醛溶液）。

称取约0.3 g新鲜黑果枸杞组培苗茎段，加1 mL提取液匀浆后定容至1 mL，60 ℃密闭浸提30 min，每5 min颠倒混匀5次；12 000 rpm离心10 min，取上清备用。可见分光光度计预热30 min，试剂一、试剂二室温预热10 min；取250 μL上清加750 μL试剂一（4倍稀释），40 ℃避光静置20 min，测530 nm和700 nm吸光度A1、A2；同法以试剂二替代试剂一，吸光度分别记为A3、A4。控制A1保持在0.1~1.0之间。

\mathrm{\Delta }A=(A\mathrm{1}-A\mathrm{2})-(A\mathrm{3}-A\mathrm{4})（1）

\rho =\left[\mathrm{\Delta }A\times V÷(\epsilon \times d)\times M\times F\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{6}}\right]

=\mathrm{16.7}\times \mathrm{\Delta }A\times F（2）

式中：V为提取液体积；ε为花青素的摩尔消光系数，2.69×10⁴；M为花青素的相对分子质量，449.2 g·mol^-1；d是比色皿光径，1 cm；F为稀释倍数，10⁶。ΔA线性范围0.005~1.000；ρ为花青素总质量浓度，μg·mL^-1。

1.8　转录组测序样品检测与文库构建

以黑果枸杞野生型（WT）和LrMYB64过表达株系为试验材料。待植株生长至25 d，分别采集幼嫩叶片。设置3个生物学重复，共6份样品。样品采集后立即用液氮速冻，并于超低温冰箱中-80 ℃保存。使用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的纯度与浓度，并利用Agilent 2100精确评估其完整性。RNA样品合格后，通过mRNA富集、随机打断、合成并纯化cDNA、末端修复加接头及PCR富集等步骤构建cDNA文库（3个生物学重复）。随后使用Qubit 3.0荧光定量仪对文库进行初步定量，并通过Qsep400系统检测插入片段大小，最后利用Q-PCR方法准确定量文库有效浓度（要求>2 nmol·L^-1）。质检完全合格的文库最终使用高通量测序平台进行PE150双端测序。

1.9　测序数据质控与序列比对

将测序得到的原始数据进行质量检测，过滤接头和低质量读段，获得高质量洁净数据（Clean Data），使用HISAT2软件将各样本的Clean Reads与黑果枸杞参考基因组（Lycium_ruthenicum.QHQ1_V1.genome.fa）进行序列比对。基于比对结果，利用StringTie软件进行转录本的重新组装与表达量计算，采用FPKM值对基因表达水平进行标准化定量。以Fold Change ≥2且FDR<0.01作为筛选阈值鉴定不同遗传背景下的表达差异，使用DESeq2软件对设定的比较组（MYB64_vs_WT）进行差异表达基因分析。通过DIAMOND、InterProScan等工具将全部基因及差异基因序列与NR、Swiss-Prot、KEGG等多个公共数据库进行比对，完成系统的功能注释，并采用超几何检验方法对差异表达基因进行KEGG通路富集分析。

1.10　荧光定量PCR验证

采用RNA Easy Fast Tissue/Cell Kit试剂盒（天根生物科技有限公司，中国）分别提取黑果枸杞野生型株系和过表达LrMYB64株系的总RNA。将得到的总RNA通过凝胶电泳试验确认提取成功后，使用NanoDrop分光光度计测量260/230和260/280吸光度比值检验RNA的提取质量。选取1.5 μg总RNA，采用天根FastQuant RT试剂盒（含gDNase，天根生物科技有限公司，中国）按照说明书流程进行逆转录反应。采用Real Master Mix PCR试剂盒（宝日医生物技术有限公司，中国）进行RT-qPCR试验，具体体系为10 μL 2×SYBR qPCR Mix、1 μL DNA模板（DNA模板稀释5倍）、0.4 μL引物F、0.4 μL引物R、8.4 μL ddH₂O。本研究选用的基因及引物见表4。每个处理采用3个生物学重复。最终于7500 fast实时荧光定量PCR系统完成试验，qPCR反应程序如表5所示。最后使用2^-ΔΔCt法分析LrMYB64和6个差异表达基因的相对表达量。

1.11　数据处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。在对不同因素显著性分析时，P<0.05代表显著，用*表示；P<0.001代表非常显著，用***表示。利用Prism 9.0和Microsoft Excel 2021分别制作相关图片和表格。在BMK Cloud（www.biocloud.net）在线云平台分析转录组测序结果。

2 结果与分析

2.1　黑果枸杞 LrMYB64 基因克隆及双元表达载体构建

以黑果枸杞茎、叶cDNA为模板，成功克隆到LrMYB64基因（图2A）。后续测序结果（图2B）具有完整的开放性阅读框（ORF）。LrMYB64基因CDS全长534 bp，共编码178个氨基酸，基因长度与电泳显示结果一致。将测序结果与宁夏枸杞（Lycium barbarum）基因组比对后确认其结构完整，序列基本一致，判定LrMYB64基因克隆正确。

以LrMYB64基因的T载体重组质粒为模板，进行同源臂扩增，并利用XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶对pBI121-eGFP空载载体进行双酶切使其线性化。后续将目的基因片段与线性化载体产物经过连接酶连接后转入大肠杆菌，测序无误后提取质粒转入农杆菌GV3101。农杆菌PCR检测显示条带证明表达载体构建成功（图2C）。

2.2　亚细胞定位分析

为明确LrMYB64蛋白的亚细胞定位，构建pBI121-35S：：LrMYB64-eGFP融合表达载体并在本氏烟草表皮细胞中瞬时表达。利用共聚焦显微镜（徕卡微系统有限公司，德国）观察发现，绿色荧光信号特异性富集于细胞核内，与对照组（空载eGFP）的全细胞分布形成鲜明对比（图3）。该结果证实LrMYB64是一个核定位蛋白，与其作为转录因子的特点相符。

2.3　 LrMYB64 基因过表达黑果枸杞鉴定

为了进一步探究LrMYB64基因调控黑果枸杞花青素的生物合成和激素响应过程，利用农杆菌介导的叶盘转化法在本源物种黑果枸杞中对LrMYB64基因进行过表达，并利用35s和基因引物分别对转基因植株进行阳性鉴定（引物序列如表3）。在DNA水平鉴定基础上，以抗性苗的cDNA为模板，利用RT-PCR在RNA水平完成进一步的鉴定工作，最终鉴定出6个LrMYB64基因过表达株系（图4）。

2.4　 LrMYB64 基因过表达黑果枸杞表型分析

选择稳定过表达LrMYB64的转基因黑果枸杞株系，观察得到2个一致且显著的形态学变化。观察野生型与LrMYB64基因过表达黑果枸杞株系之间的表型差异发现，LrMYB64基因过表达株系与野生型相比整株呈现纯绿色（图5A），差异显著，推测是花青素积累减少所致。测定野生型与LrMYB64基因过表达黑果枸杞茎干的花青素水平发现，LrMYB64基因过表达株系花青素水平显著降低91.75%（图5B），表明LrMYB64基因调控花青素水平下调导致整株呈现绿色。同时发现，与野生型对照相比，LrMYB64基因过表达株系腋芽萌发数量显著增多。去除顶芽后，这种促进作用更为明显，转基因植株的腋芽萌发速率和数量均显著提高，其平均腋芽数量比野生型增加约3倍（图6），表明LrMYB64基因正调控腋芽发育。

2.5　转录组数据概况

为解析上述表型变化的分子机制，对黑果枸杞野生型（WT）和LrMYB64基因过表达株系（OE）2个组共6个样品的幼嫩茎、叶进行RNA-seq测序。测序数据质量优异，测序错误率极低，样品Q30碱基百分比均高于98.30%（表6），且与参考基因组的唯一比对率超过90.70%（表7），该结果表明，测序数据与参考基因组具有很高的匹配度，数据利用率高，可用于后续准确的基因表达分析。差异表达分析（\left|\mathrm{l}\mathrm{o}{\mathrm{g}}_{\mathrm{2}}(F_{\mathrm{C}})\right|\ge \mathrm{1}，FDR<0.01）共鉴定出1 728个差异表达基因，其中在过表达株系组中下调基因数量（1 151个）约为上调基因数量（577个）的2倍（图7A）。这一全基因组水平的转录变化为LrMYB64基因的广泛调控功能提供了证据。

2.6　 LrMYB64 基因过表达抑制花青素合成

基因表达热图显示（图7B），过表达株系中大量基因表达模式都发生了一致性变化，表明LrMYB64基因稳定调控下游转录网络。KEGG通路富集分析进一步确认，下调基因在花青素生物合成与类黄酮生物合成通路中高度富集，而上调基因则富集于光合作用天线蛋白、植物激素信号转导及角质、软木脂和蜡质生物合成等通路（图7C），部分基因参见表8~9。这表明LrMYB64基因过表达抑制色素合成，同时激活能量代谢、生长信号与结构发育相关通路。

进一步分析关键基因的共表达网络，结果显示（图8A），LrMYB64基因与整个花青素合成基因簇呈显著负相关，包括上游的苯丙氨酸解氨酶基因（LrPAL）、核心结构基因（如LrCHS1B、LrCHS2、LrF3H、LrF3'5'H1）及下游修饰基因（LrA3GT、LrA3G2XYLT）。由此从转录互作层面证实，LrMYB64基因抑制从底物合成到终产物修饰的完整花青素合成通路，从而在分子水平上直接解释了花青素积累减少引起的植株表型变化。

2.7　 LrMYB64 基因过表达重构激素信号并促进腋芽生长

与野生型相比，3个LrMYB64基因过表达系（LrMYB64-2/6/7）中，对关键差异上调表达基因进行共表达相关性分析。在上调基因群中（图8B），LrMYB64基因与光合系统相关基因（如LrPSBR、LrCAB2）及生长激素响应基因（如LrSAUR36、LrGH3.6L）呈高度正相关，形成1个与能量捕获和生长促进相关的共表达模块。KEGG分析揭示，上调基因显著富集于生长素（IAA）和细胞分裂素（CK）等激素信号通路。其中，IAA信号通路中的LrARF5、LrARF9基因（激活因子）表达上调，而LrIAA14基因（抑制因子）表达下调，同时LrGH3.6家族基因（参与IAA酰胺化）表达显著上调，提示IAA信号响应被激活，但自由IAA水平可能被降低，这有助于解除顶端优势。此外，细胞分裂素信号通路中的LrAHP4等基因表达下调，建立新的激素平衡态。

2.8　 qRT-PCR验证相关候选基因

为了验证转录组数据结果可靠性及与花青素合成或生长相关的候选基因，选择LRMYB64和6个差异表达基因进行qRT-PCR分析（图9）。结果显示，同一基因在野生型（WT）与不同OE-LrMYB64株系间存在显著表达差异。OE-LrMYB64株系中LrMYB64基因转录水平比野生型高100倍，说明该基因成功过表达。LrPP2C51、LrGH3.6-like2基因在过表达各株系中呈现异位高表达，表达量均在30倍以上；LrCHI3、LrF3H、LrDFR、LrFLS1基因在本底表达较低，在过表达株系中几乎检测不到，显著低于野生型，与转录组测序结果完全一致。

3 讨论

R2R3-MYB转录因子是植物次生代谢与发育程序的关键调控枢纽。本研究在黑果枸杞中同源转化LrMYB64基因，研究发现其同时作为花青素合成的强抑制因子和IAA等激素信号通路关键促进因子，通过调控多层级的转录网络，协同实现抑制花青素合成与促进腋芽生长。这一发现将苯丙烷类代谢与侧生器官发育这2条通常被独立研究的通路整合于同一转录调控节点，为理解植物通过转录重编程协调防御性代谢与形态可塑性提供新颖的模型。

本研究在过表达LrMYB64基因株系中发现茎杆花青素水平骤降91%，且苯丙烷通路核心结构基因（LrPAL、LrCHS、LrDFR）表达同步下调，表明该基因是R2R3-MYB亚家族中的抑制因子。LrMYB64基因与杨树（Populus）的PtrMYB57基因^［32］、杨梅（Myrica rubra）的MrMYB6基因^［33］及苹果的MdMYB306-like基因^［34］功效相同，由此推测其可能通过特异性抑制花青素积累来精细调控色素沉积。序列分析显示，LrMYB64基因C端含有典型的EAR抑制基序（LxxLxxL），预示其可能通过招募TPL/HDAC等共抑制复合体，直接抑制靶基因转录。此外，LrMYB64也可能与激活型MYB转录因子竞争有限的bHLH伴侣，从而瓦解经典的MBW激活复合体。该结果丰富了花青素合成MYB抑制子调控模块在枸杞属植物中的认知。

与对代谢的抑制效应相反，LrMYB64基因正调控黑果枸杞的发育过程。过表达植株腋芽数量增至野生型3倍以上，且在去除顶芽后腋芽萌发与伸长更为迅速。这一表型与多种激活型MYB转录因子调控器官发生的功能相吻合，如黄瓜CsMYB36基因促进细胞扩张以塑造果颈^［28］，以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtMYB2和AtMYB108在ARF7下游与LBD29互作以驱动侧根发生^［35］。转录组数据显示，LrMYB64基因过表达协同激活IAA酰胺合成酶基因LrGH3.6^［36］（促进IAA钝化）及多个CK信号基因。过表达植株可能通过降低顶端游离IAA浓度及提高根源CK输出，使得腋芽处IAA/CK下降，进而解除顶端优势。尤为重要的是，去顶处理显著放大该表型，推测LrMYB64基因可能并未绕过IAA信号，而是增强腋芽分生组织对极性IAA流中断的敏感性。这种通过调控激素平衡来精确控制腋芽发育的模式，与草莓（Fragaria×ananassa）中抑制腋芽萌发的FveMYB117a基因功能相反^［37］，凸显MYB家族在该过程中的功能多样性。

单个MYB因子同时抑制花青素并促进生长的现象，揭示了次生代谢与发育决策之间深刻的资源权衡关系。类似的双功能案例鲜见于其他物种，杨树中PtoMYB10基因促进次生壁加厚的同时抑制花青素^［38］及菊花中CmMYB8基因同时抑制木质素与类黄酮合成^［29］等研究为LrMYB64基因协同调控次生代谢与生长发育提供思路。LrMYB64基因调控模式以牺牲防御性色素为代价，将碳流和氮源转向营养生长。花青素合成消耗大量苯丙氨酸和丙二酰-CoA前体；抑制该通路可扩大IAA和CK等激素信号通路共享前体存量，为激素合成提供更多底物。对于黑果枸杞这类生存于波动环境中的荒漠灌木而言，在短暂的适宜窗口期（如雨后）快速抑制消耗性代谢、启动枝条增殖以扩大光合冠层，是其关键的适应策略。因此，LrMYB64基因可能充当感知环境信号（如光照、损伤等）并触发从防御到生长代谢切换的分子开关。

本研究确立了LrMYB64基因在花青素合成和腋芽发育中的关键调控节点，明确了其负向调控花青素合成的同时正向促进腋芽萌发的双重功能，提出了其通过激素网络耦合双重功能的模型。然而，其直接靶基因谱尚未明确，对花青素的抑制是细胞自主性还是系统性效应，也有待厘清。未来对作用机制的进一步研究，有望阐明LrMYB64基因在黑果枸杞适应性与经济性状形成中的精确作用，为作物株型与品质的协同改良提供新的基因资源。

参考文献

[1] 杨慧勤，王佳丽，李思蕤，等.茄科蔬菜花青素苷分子调控研究进展［J］.生物工程学报，2022，38（5）：1738-1752.

[2] YANG H Q， WANG J L， LI S R，et al.Advances in the molecular regulation of anthocyanins in solanaceous vegetables［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2022，38（5）：1738-1752.

[3] 于洋，朱月，刘晗，等.茄果类蔬菜花青素研究进展［J］.贵州农业科学，2021，49（8）：120-127.

[4] YU Y， ZHU Y， LIU H，et al.Research progress on anthocyanins in solanaceous vegetables［J］.Guizhou Agricultural Sciences，2021，49（8）：120-127.

[5] JEZ J M， NOEL J P.Mechanism of chalcone synthase.pK_a of the catalytic cysteine and the role of the conserved histidine in a plant polyketide synthase［J］.Journal of Biological Chemistry，2000，275（50）：39640-39646.

[6] 吴榕，田再民，郑国华，等.白三叶CHS基因的过表达提高烟草类黄酮的含量［J］.草业科学，2020，37（2）：305-313.

[7] WU R， TIAN Z M， ZHENG G H，et al.Overexpression of CHS genes from Trifolium repens increases tobacco flavonoid content［J］.Pratacultural Science，2020，37（2）：305-313.

[8] 宋天晓，苏文瑾，刘意，等.甘薯黄烷酮3-羟化酶基因IbF3H的克隆和表达特性分析［J］.热带作物学报，2021，42（6）：1531-1538.

[9] SONG T X， SU W J， LIU Y，et al.Cloning and expression analysis of sweetpotato flavanone 3-hydroxylase gene IbF3H ［J］.Chinese Journal of Tropical Crops，2021，42（6）：1531-1538.

[10] 吴万亿，张毅，张洁，等.马铃薯LINC4206及其靶基因StDFR的克隆与StDFR的生物信息学分析［J］.山西农业科学，2021，49（6）：683-688.

[11] WU W Y， ZHANG Y， ZHANG J，et al.Cloning of LINC4206 and its target gene StDFR and bioinformatics analysis of StDFR in potato［J］.Journal of Shanxi Agricultural Sciences，2021，49（6）：683-688.

[12] 姚建忠.毛白杨花青素合酶基因的克隆与特性分析［J］.中国细胞生物学学报，2018，40（3）：349-356.

[13] YAO J Z.Molecular cloning and characterization of two genes encoding anthocyanin synthase from Populus tomentosa ［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2018，40（3）：349-356.

[14] 常博，马长青，刘聪，等. MdMYB1启动子甲基化对不同色泽类型苹果品种果皮花青苷合成的调控作用［J］.分子植物育种，2018，16（22）：7415-7422.

[15] CHANG B， MA C Q， LIU C，et al.Regulation of MdMYB1 promoter methylation on anthocyanin synthesis in peel of apple （Malus×domestica Borkh.） cultivars with different colors［J］.Molecular Plant Breeding，2018，16（22）：7415-7422.

[16] AN X H， TIAN Y， CHEN K Q，et al. MdMYB9 and MdMYB11 are involved in the regulation of the JA-induced biosynthesis of anthocyanin and proanthocyanidin in apples［J］.Plant and Cell Physiology，2015，56（4）：650-662.

[17] LI P， LI Y J， ZHANG F J，et al.The Arabidopsis UDP-glycosyltransferases UGT79B2 and UGT79B3，contribute to cold，salt and drought stress tolerance via modulating anthocyanin accumulation［J］.The Plant Journal，2017，89（1）：85-103.

[18] 王华，李茂福，杨媛，等.果实花青素生物合成分子机制研究进展［J］.植物生理学报，2015，51（1）：29-43.

[19] WANG H， LI M F， YANG Y，et al.Recent advances on the molecular mechanisms of anthocyanin synthesis in fruits［J］.Plant Physiology Journal，2015，51（1）：29-43.

[20] HOLTON T A， CORNISH E C.Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis［J］.The Plant Cell，1995，7（7）：1071-1083.

[21] GONZALI S， MAZZUCATO A， PERATA P.Purple as a tomato：towards high anthocyanin tomatoes［J］.Trends in Plant Science，2009，14（5）：237-241.

[22] AN X H， TIAN Y， CHEN K Q，et al.The apple WD40 protein MdTTG1 interacts with bHLH but not MYB proteins to regulate anthocyanin accumulation［J］.Journal of Plant Physiology，2012，169（7）：710-717.

[23] QUATTROCCHIO F， VERWEIJ W， KROON A，et al.PH4 of Petunia is an R2R3 MYB protein that activates vacuolar acidification through interactions with basic-helix-loop-helix transcription factors of the anthocyanin pathway［J］.The Plant Cell，2006，18（5）：1274-1291.

[24] KOES R， VERWEIJ W， QUATTROCCHIO F.Flavonoids：a colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways［J］.Trends in Plant Science，2005，10（5）：236-242.

[25] 柯玉洁，陈明堃，马山虎，等.兰科植物MYB转录因子研究进展［J］.园艺学报，2021，48（11）：2311-2320.

[26] KE Y J， CHEN M K， MA S H，et al.Research progress of MYB transcription factors in Orchidaceae［J］.Acta Horticulturae Sinica，2021，48（11）：2311-2320.

[27] MATÍAS-HERNÁNDEZ L， JIANG W M， YANG K，et al.AaMYB1 and its orthologue AtMYB61 affect terpene metabolism and trichome development in Artemisia annua and Arabidopsis thaliana ［J］.The Plant Journal，2017，90（3）：520-534.

[28] LU Z J， ZHU L J， LIANG G B，et al.MORE FLORET1 controls anther development by negatively regulating key tapetal genes in both diploid and tetraploid rice［J］.Plant Physiology，2024，195（3）：1981-1994.

[29] CAO Y P， LI K， LI Y L，et al.MYB transcription factors as regulators of secondary metabolism in plants［J］.Biology，2020，9（3）：61.

[30] WANG S S， JIANG R Y， FENG J，et al.Overexpression of transcription factor FaMYB63 enhances salt tolerance by directly binding to the SOS1 promoter in Arabidopsis thaliana ［J］.Plant Molecular Biology，2024，114（2）：32.

[31] PAZ-ARES J， GHOSAL D， WIENAND U，et al.The regulatory c1 locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto‐oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators［J］.The EMBO Journal，1987，6（12）：3553-3558.

[32] DELUC L， BARRIEU F， MARCHIVE C，et al.Characterization of a grapevine R2R3-MYB transcription factor that regulates the phenylpropanoid pathway［J］.Plant Ph-ysiology，2006，140（2）：499-511.

[33] VIMOLMANGKANG S， HAN Y P， WEI G C，et al.An apple MYB transcription factor，MdMYB3，is involved in regulation of anthocyanin biosynthesis and flower development［J］.BMC Plant Biology，2013，13：176.

[34] LI S H， DONG Y X， LI D L，et al.Eggplant transcription factor SmMYB5 integrates jasmonate and light signaling during anthocyanin biosynthesis［J］.Plant Physiology，2024，194（2）：1139-1165.

[35] ZHOU L J， GENG Z Q， WANG Y X，et al.A novel transcription factor CmMYB012 inhibits flavone and anthocyanin biosynthesis in response to high temperatures in chrysanthemum［J］.Horticulture Research，2021，8（1）：248.

[36] WANG X X， WANG J C， LIU Z Y，et al.The R2R3 MYB gene TaMYB305 positively regulates anther and pollen development in thermo-sensitive male-sterility wheat with Aegilops kotschyi cytoplasm［J］.Planta，2024，259（3）：64.

[37] WANG C H， YAO H X， WANG C，et al.Transcription factor CsMYB36 regulates fruit neck length via mediating cell expansion in cucumber［J］.Plant Physiology，2024，195（2）：958-969.

[38] ZHU L， GUAN Y X， ZHANG Z H，et al. CmMYB8 encodes an R2R3 MYB transcription factor which represses lignin and flavonoid synthesis in chrysanthemum［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2020，149：217-224.

[39] SUN C D， HUANG H Z， XU C J，et al.Biological activities of extracts from Chinese bayberry （Myrica rubra Sieb.et Zucc.）：a review［J］.Plant Foods for Human Nutrition，2013，68（2）：97-106.

[40] 庞沁，陈成标，邹登朗，等.黑果枸杞花青素研究概述［J］.农家参谋，2022（18）：114-116.

[41] PANG Q， CHEN C B， ZOU D L，et al.Overview of anthocyanin research in Lycium ruthenicum ［J］.The Farmers Consultant，2022（18）：114-116.

[42] WAN S Z， LI C F， MA X D，et al.PtrMYB57 contributes to the negative regulation of anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in poplar［J］.Plant Cell Reports，2017，36（8）：1263-1276.

[43] SHI L Y， CHEN X， WANG K，et al.MrMYB6 from Chinese bayberry （Myrica rubra） negatively regulates anthocyanin and proanthocyanidin accumulation［J］.Frontiers in Plant Science，2021，12：685654.

[44] WANG S， ZHANG Z， LI L X，et al.Apple MdMYB306-like inhibits anthocyanin synthesis by directly interacting with MdMYB17 and MdbHLH33［J］.The Plant Journal，2022，110（4）：1021-1034.

[45] ZHANG F， WANG J X， DING T T，et al.MYB2 and MYB108 regulate lateral root development by interacting with LBD29 in Arabidopsis thaliana ［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2024，66（8）：1675-1687.

[46] JIANG L J， ZHANG D H， LIU C，et al.MdGH3.6 is targeted by MdMYB94 and plays a negative role in apple water-deficit stress tolerance［J］.The Plant Journal，2022，109（5）：1271-1289.

[47] HAN Y F， QU M H， LIU Z C，et al.Transcription factor FveMYB117a inhibits axillary bud outgrowth by regulating cytokinin homeostasis in woodland strawberry［J］.The Plant Cell，2024，36（6）：2427-2446.

[48] JIANG P F， LIN X Y， BIAN X Y，et al.Ectopic expression of Populus MYB10 promotes secondary cell wall thickening and inhibits anthocyanin accumulation［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2022，172：24-32.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(32572017)

宁夏重点研发项目(2022BBF01001-02)