长白山林区3种基原细辛差异性成分比较

Comparative Analysis of Differential Components of Three Origins ofAsari Radix et Rhizoma in Changbai Mountain Forest Region

摘要

细辛挥发油中含有多种活性成分，可以作为细辛药材质量评价的指标；理清不同基原细辛挥发油成分差异，对细辛品质研究及应用具有重要意义。利用气质联用（GC-MS）法对不同基原细辛挥发油成分进行定性及相对定量分析，结合数据分析软件，通过聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）找出不同基原细辛的差异性化合物。结果表明：25个批次的细辛样品共检测出59种化合物，按照不同基原划分为3类；细辛挥发性成分差异与细辛基原具有明显关联，确定α-松油醇、肉豆蔻醚、莰烯等11种化合物是不同基原细辛的差异性成分。基于化学计量学方法筛选到的差异成分可以区分不同基原细辛，同时可为细辛资源合理利用提供科学依据。

Abstract

The volatile oil contains many kinds of active ingredients， which can be used as an indicator for the quality evaluation of Asari Radix et Rhizoma， and the difference of volatile oil components of different origins is of great significance for the quality research and development and application of Asari Radix et Rhizoma. Gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） was used to qualitatively and relatively quantify the volatile oil components of different origins， combined with data analysis software， and the differential compounds of different origins were identified by cluster analysis（HCA）， principal component analysis（PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）. The results showed that a total of 59 compounds were detected in 25 batches of Asari Radix et Rhizomasamples， which could be divided into three categories according to different origins. Further analysis showed that the difference in volatile components of Asari Radix et Rhizoma was significantly correlated with different origins， and 11 compounds such as α-terpineol， myristic ether and camphene were identified as different components of different origins. The differential components screened by chemometrics can be used to distinguish different origins and provide a comprehensive reference for the rational use of Asari Radix et Rhizoma resources.

Graphical abstract

关键词

细辛 / 挥发油 / 化学计量学 / 气相色谱质谱 / 成分分析

Key words

Asari Radix et Rhizoma / volatile oil / chemometrics / GC-MS / component analysis

细辛（Asari Radix et Rhizoma）作为一种中药材，是中医临床常用的解表药，其药用历史悠久。《中国药典》规定细辛是马兜铃科（Aristolochiaceae）细辛属（Asarum）北细辛（Asarum heterotropoides var. mandshuricum）、汉城细辛（Asarum sieboldii var. seoulense）和华细辛（Asarum sieboldii）3种基原的干燥根和根茎^［1］。北细辛主要集中分布在东北三省的长白山脉，汉城细辛集中分布在辽宁和吉林两省东南部的长白山脉，华细辛则集中分布在陕西、山东、安徽、浙江、江西、湖北、湖南等山区^［2］。针阔混交林下、灌丛、林缘地及阴湿地是3种基原细辛的自然生境。细辛作为中药材，有解表散寒、祛风止痛、温肺化饮等功效，常常被用于风寒感冒、风湿痹痛等病证的治疗^［3-4］。

挥发油和非挥发性物质是细辛主要的化学成分。细辛的挥发油含量基本在3%以下^［5］。王波等^［6］对不同品种细辛中的挥发油成分进行提取分析，发现其中的化学成分主要有不饱和烯烃及醛、酮、酚类不饱和含氧化合物，其中甲基丁香酚、黄樟醚、肉豆蔻醚等小分子化合物含量相对较高。北细辛挥发油的主要成分是甲基丁香酚、黄樟醚、3，5-二甲氧基甲苯和优葛缕酮，汉城细辛挥发油的主要成分是甲基丁香酚、优葛缕酮和榄香素。细辛的化学成分因产地不同而有所差异。李君辉等^［7］从7个不同产地北细辛挥发油中鉴定出55种化合物，包括甲基丁香酚、黄樟醚、3，5-二甲氧基甲苯、肉豆蔻醚和榄香素等；刘东吉和刘春生^［8］从5个不同产地辽细辛挥发油中鉴定出60种化学成分，主要有效成分为3，5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚、肉豆蔻醚等。不同产地的细辛挥发油成分（如甲基丁香酚与黄樟醚）可能相同，但其含量可能有所不同。Li等^［9］采用顶空气相色谱-质谱联用技术分析北细辛和华细辛中挥发油成分，发现桉树脑、左旋香芹酮、3，5-二甲氧基甲苯、 3，4，5-三甲氧基甲苯、甲基丁香酚和2，3，5-三甲氧基甲苯、科绕魏素、正十五烷、细辛醚9种成分含量存在显著差异。细辛中最主要的非挥发性化合物有木脂素类化合物、黄酮苷类化合物及多糖类化合物^［10］。吴昊等^［11］发现细辛中含量较高的非挥发性成分主要有卡枯醇、芝麻脂素和细辛脂素。

综上所述，不同基原细辛在挥发油和非挥发性化学成分的种类和含量都存在一定差异。不同基原细辛通常在外观形态上不易区分，但其成分存在较大差异。目前，相关研究主要聚焦于单一或2种基原细辛的化学成分及含量测定和比较，对于3种基原细辛化学成分的比较研究并不多见。本研究利用GC-MS和UPLC法对取材于长白山林区的 3种基原细辛的挥发性成分及非挥发性化学成分进行检测分析，通过聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）找出不同基原细辛的差异性化合物，为不同基原细辛的合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1　试验样品

试验样品取自吉林省吉林市昌邑区左家镇农业部长白山野生生物资源重点科学观测试验站北方药用植物资源圃中的北细辛、汉城细辛和华细辛6年生植株共25份。样品信息及分组情况详见表1。

1.2　挥发油提取

使用电子天平（PTT-1000，美国）称取细辛粉末（过筛孔径：（850±29） μm）45 g，加入10倍体积的蒸馏水，按照2020年版《中国药典》四部（通则2204）中的方法进行挥发油提取。在提取得到的挥发油中，加入一定量的无水硫酸钠，在4 ℃条件下静置12 h，去除残留水分，分装在微量瓶中读数。用移液枪吸取挥发油50 μL至1.5 mL离心管中，加入正己烷稀释20倍，过0.22 μm有机滤膜，置于微量瓶中待测。

1.3　非挥发性成分细辛脂素和芝麻脂素的提取

称取细辛粉末0.5 g，加入10 mL甲醇（色谱纯，Fisher ScIentIfIc公司），超声提取40 min，在温度40 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm PTEE过滤器过滤，取700 μL用于高效液相色谱检测分析。

1.4　GC-MS条件

使用气相色谱质谱联用仪（Agilent 7890B-7000D，配Mass-hunter质谱工作站、NITS 14标准谱图库，美国）进行挥发性成分测定。

色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）。程序升温条件：初始温度40 ℃，保持5 min，以5 ℃·min^-1升至200 ℃，再以10 ℃·min^-1升至280 ℃，保持5 min；进样口温度250 ℃，载气为高纯氦气（纯度99.999 9%），柱流量1.0 mL·min^-1，进样量1.0 μL，分流比20∶1。

MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，溶剂延迟时间3 min，质量扫描范围40~600 m/z。

1.5　UPLC条件

使用Acquity超高效液相色谱仪（Waters公司，美国）进行非挥发性成分测定。

色谱柱，Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相，乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）（A）-水（Millipore）（B）；流速，0.5 mL·min^-1；检测波长，287 nm；柱温，35 ℃。UPLC测定条件如表2所示。

1.6　GC-MS定量定性方法

通过与NITS 14质谱图数据库进行比对，结合文献^［5-9］，对细辛中挥发性成分进行鉴定和比较。利用峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。

1.7　数据处理

通过水蒸气蒸馏法提取不同基原细辛样品 的挥发油，除水后计算得率，挥发油得率（R_A）计算公式为

R_{\mathrm{A}}=\frac{m_{\mathrm{1}}}{m_{\mathrm{2}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（1）

式中：m₁表示所提取得到的挥发油的质量（g）；m₂表示用于提取挥发油的原材料的质量（g）。使用SPSS 22.0软件对3种基原细辛样本挥发油得率进行显著性差异分析，以P作为方差齐性的判定基准，P<0.05表示3种基原细辛的挥发油得率存在显著差异；使用SAS软件对25个批次的细辛样品挥发油成分数据进行标准化处理，使用系统聚类分析法进行聚类分析，用欧式距离作为标准进行测量，得到聚类树状图；使用SIMCA 14.1软件进行数据统计，分析3种基原细辛样品之间挥发油成分差异性；采用主成分分析（PCA）模型分析成分差异性。利用OPLS-DA分析数据进一步降维，拉大不同基原细辛的组间差距，使各样品更好分离；通过交叉验证（一种用于评估模型稳健性、预测能力和避免过拟合的技术）评估OPLS-DA模型指标，其中Q²越接近1，模型的预测能力越强；当解释方差数据R²Y较高时，模型能够很好地解释因变量的变化；进一步通过VIP值筛选出不同细辛基原之间差异的主要化学成分。最后将筛选出的11种成分利用Origin 9.0绘制热图。

2 结果与分析

2.1　挥发油得率

3种基原细辛挥发油平均得率不同（表3），其中华细辛的挥发油得率最高，为3.1%；汉城细辛的挥发油得率最低，为2.3%，不同基原细辛的挥发油得率均在2%~4%的范围内，根据单因素方差分析，华细辛与汉城细辛挥发油之间差异显著（F=13.224，P<0.05），而北细辛与华细辛挥发油得率无显著差异。

2.2　归一化法成分相对定量分析

对3种细辛的提取物使用正己烷稀释20倍后过0.22 μm滤膜后上机分析，得到GC-MS谱图，进行谱库检索，匹配度达到90%以上的各组分信息见表4。从表4可知：不同基原细辛样品中共鉴定出59种挥发性成分，北细辛、华细辛和汉城细辛中分别检测到49、27、33种挥发性物质；3种基原细辛共鉴定出19种共有组分，分别为β-松油烯、莰烯、β-月桂烯、β-罗勒烯、水芹烯、柠檬烯、β-侧柏烯、邻伞花烃、桉树脑、顺式-4-蒈烯、（-）-4-萜品醇、合成右旋龙脑、双环［2.2.1］-2-庚醇、α-松油醇、 3，5-二甲氧基甲苯、黄樟醚、甲基丁香酚、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯、肉豆蔻醚。虽然为共有物质，但其在含量上存在较大差异。

2.3　多元统计分析

2.3.1　层次聚类分析

不同基原细辛按挥发油组成成分被分为3类（图1），其中S1-S17聚为一类，为北细辛；S18-S22聚为一类，为华细辛；S23-S25聚为一类，为汉城细辛。聚类分析结果表明，挥发油成分在不同基原细辛之间差异较大，而在同一基原细辛不同产地之间差异较小。

2.3.2　主成分分析

为了更好地分析不同基原细辛样品之间挥发油成分差异性，采用主成分分析（PCA）模型进行分析。由模型验证参数可知，数据矩阵解释率参数R²X=0.623，模型预测参数Q²Y=0.593，2个值均大于0.5，证明模型稳定，具有较高的预测准确度。

图2A结果表明，25个批次的细辛样品被分为3类，基原相同的细辛样品被聚为一类，且同一基原细辛样品的离散度较小。主成分分析结果显示，PC1解释了华细辛和其他2种细辛所含挥发油成分的主要差别，PC2解释了汉城细辛和其他2种细辛所含挥发油成分的主要差别。在PC1，华细辛与其他2种细辛有显著差异的化合物为（-）-4-萜品醇、α-松油醇和肉豆蔻醚；在PC2，汉城细辛与其他基原细辛有显著差异的化合物是2-异丙基-5-甲基茴香醚和水芹烯。

2.3.3　OPLS-DA分析

与PCA相比，OPLS-DA分析结果显示，3种基原细辛组内差异变小，同基原的样品更加集中；而组间差异变大，使其得到更好的区分（图3）。由交叉验证模型可知，累计R²Y = 0.945，Q² = 0.893，证明其预测准确性优于PCA模型。根据P值（P<0.05）和VIP值（VIP>1.0）筛选潜在的化学标志物，3种基原细辛中共筛选出11种差异化学标记物，分别为C29（α-松油醇）、C51（肉豆蔻醚）、C2（莰烯）、C31（黄樟醚）、C49（1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯）、C8（水芹烯）、C1（β-松油烯）、C18（顺式-4-蒈烯）、C46（甲基丁香酚）、C57（百秋李醇）和C26（草蒿脑）。

2.3.4　热图分析

为了更直观地观察不同基原细辛之间挥发油成分的差异，将筛选得到的11种化学标记物进行热图分析。11种成分大致聚为3类，结果如图4所示。

C1（β-松油烯）在北细辛中的相对含量（3.86%）高于华细辛（1.74%）和汉城细辛（1.58%），C2（莰烯）的相对含量（1.12%）高于华细辛（0.11%）和汉城细辛（0.28%）。C49（1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯）在北细辛中的相对含量达到8.82%，在汉城细辛中的相对含量次之（2.05%），在华细辛中的相对含量最低（0.30%）；C57（百秋李醇）只在北细辛中被检测到，在其他2种细辛中未被检测到。因此，C1、C2、C49在北细辛中的高含量表达可以作为其与其他细辛的区别，而C57只在北细辛中被检测到，可以作为其特征性差异成分。

C29（α-松油醇）在华细辛中的相对含量为2.89%，高于北细辛（0.48%）和汉城细辛（0.19%）；C51（肉豆蔻醚）的相对含量为15.31%，高于北细辛（2.13%）和汉城细辛（0.20%）。高含量的C29和C51可以作为区分华细辛和其他2种细辛的重要条件之一。细辛挥发油组分C46（甲基丁香酚）在汉城细辛中的相对含量最高（20.94%）、北细辛次之（15.17%）、华细辛最低（0.79%）。因此，极低含量的C46也成为区分华细辛和其他2种细辛的关键因素。

C8（水芹烯）在汉城细辛中的相对含量为2.96%，高于北细辛（0.63%）和华细辛（0.89%）；C18（4-蒈烯）在汉城细辛中的相对含量为1.07%，高于北细辛（0.60%）和华细辛（0.05%）。高含量的C8和C18可作为汉城细辛中的特征性化合物。C31（黄樟醚）在汉城细辛中的相对含量最少，仅为1.55%，而在北细辛和华细辛中的相对含量均为18%以上。低含量的C31也作为汉城细辛与其他细辛的重要区分指标。

C26（草蒿脑）在汉城细辛和北细辛中的相对含量分别为5.86%和1.03%，因其含量过低导致该成分在华细辛中未被检测到。因此，C26的有无可用于区分华细辛和其他细辛，而相对含量高低可以区分北细辛和汉城细辛。

2.3.5　细辛脂素和芝麻脂素含量

在北细辛、华细辛、汉城细辛中，细辛脂素质量分数分别是（0.776±0.059）、（0.803±0.026）、（0.684±0.011） mg·g^-1，芝麻脂素质量分数分别为（0.812±0.086）、（0.506±0.008）、（0.487±0.052） mg·g^-1（图5）。华细辛中的细辛脂素含量显著高于汉城细辛（P<0.05），但与北细辛无明显差异；北细辛中的芝麻脂素含量显著高于华细辛和汉城细辛（P<0.05），华细辛和汉城细辛无明显差异。

3 讨论

挥发油主要从芳香类药用植物中提取得到，细辛是芳香宣肺开窍类中药的代表药物，挥发油是其最重要的药效成分^［12］。挥发油特征性成分可作为细辛的质量标志物（quality marker，Q-Marker），通过检测该指标可以有效预测细辛的不同基原^［13］。在总挥发油中，甲基丁香酚、黄樟醚、3，5-二甲氧基甲苯和肉豆蔻醚等成分通常作为细辛质量控制指标^［14］。甲基丁香酚是一种苯丙素类化合物，具有多种药理活性，是衡量细辛品质的一个关键指标；黄樟醚、肉豆蔻醚等成分也不乏相关的毒性报道^［15］。王风等^［16］从北细辛挥发性成分中共鉴定出68种化合物，发现甲基丁香酚在其挥发性成分中占比最高。通过GC-MS与OPLS-DA分析，本研究发现北细辛与汉城细辛中的甲基丁香酚含量在挥发油成分中最高，且远高于华细辛，可作为 3种基原细辛的差异性指标。柴士伟等^［17］通过建立细辛挥发油GC-MS指纹图谱，并通过OPLS-DA模型中的VIP值筛选出8个关键色谱峰，黄樟醚、3，4，5-三甲氧基甲苯、甲基丁香酚、3，5-二甲氧基甲苯、（＋）-3-蒈烯、优葛缕酮等是不同基原细辛产生差异的主要成分。在本研究中，通过VIP值筛选到11种化合物，可作为潜在的差异特征性成分，其中黄樟醚和甲基丁香酚这2种挥发油成分与柴士伟等^［17］的研究结果相符，据此推断，这2种物质是不同基原中最显著的差异性成分，可作为3种基原细辛重要的化学鉴别物质。

细辛中还含有细辛脂素、芝麻脂素等非挥 发性成分。细辛脂素具有很好的抗病毒和抗结 核杆菌的作用，芝麻脂素具有抗氧化及抗炎作用^［18］。匡艳辉等^［19］对18批次的细辛进行成分测定，发现细辛脂素含量在辽细辛、华细辛中较高，质量分数均大于2.0 mg·g^-1，芝麻脂素质量分数为0.8~1.5 mg·g^-1。本研究中，细辛脂素和芝麻脂素质量分数均低于1.0 mg·g^-1。3种细辛比较，细辛脂素在华细辛中含量较高；而芝麻脂素在北细辛中含量较高，远高于华细辛和汉城细辛。宋双红等^［20］测定了不同品种细辛中马兜铃酸Ⅰ和细辛脂素的含量，结果发现，细辛脂素在华细辛和辽细辛中含量较高，但仅有2.4 μg·g^-1。上述结果表明：不同基原细辛中化合物成分含量差异很大，此外，不同批次、不同采收时期也会影响细辛化合物成分及含量。细辛资源来源复杂，遗传不稳定，在此背景下，细辛化学成分的质量控制难度很大，在今后的研究中，需要对质量标志物进行更深层次的挖掘，进一步完善和优化细辛质量控制指标体系和检测方法。

4 结论

本研究对长白山林区3种基原细辛挥发油进行提取、鉴定和相对定量分析，结果发现：华细辛挥发油得率最高，北细辛次之，汉城细辛最低；北细辛挥发油成分种类最丰富，不同基原细辛挥发油成分差异大，产地差异小。利用OPLS-DA分析筛选出11种化学标记物，其中β-松油烯莰烯、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯可作为北细辛的区分标志物，而百秋李醇是其特征性成分；高含量α-松油醇、肉豆蔻醚等可用于区分华细辛与其他基原细辛；高含量水芹烯、4-蒈烯等可作为汉城细辛的特征性成分。综上，北细辛差异性成分多为萜类；华细辛中萜类和芳香族为其差异性成分，部分芳香族毒性成分含量高；汉城细辛多含萜类和苯丙素类成分。这些成分标记物可区分不同基原细辛，同时可为细辛资源合理利用提供更为科学的依据。

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基金资助

吉林省科技发展计划项目(20230401047YY)

中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-ASTIP-2016-ISAPS)