一种枣植物组织改良的Steedman’s wax石蜡切片方法

An Improved Steedman’s Wax Sectioning Method for Plant Tissues of Ziziphus jujuba

摘要

为了建立一种简便、安全、快速的石蜡制片方法，减少试验过程中有毒试剂二甲苯的使用，以4个时期灵武长枣（Ziziphus jujuba ‘Lingwu Changzao’）的叶和果实为试验材料，采用改良的低熔点多酯蜡（Steedman’s wax）切片法观察不同时期的叶和果实结构特征，包括采用改良包埋试剂，省略二甲苯透明步骤，缩短试验过程，建立起一套可行的植物组织石蜡制片方法，并与常规石蜡切片方法比较，为研究植物组织结构特征提供新思路。结果表明：通过改良的低熔点多酯蜡切片法获得的叶片和果实组织的形态结构完整且染色清晰，该改良方法不但简化了试验步骤、缩短了制片周期，而且制得的切片质量与常规石蜡切片质量无差别，达到了优化试验步骤、避免二甲苯等有毒试剂使用、节省试验时间、整体上提高植物石蜡制片效率的目的，值得用于更多植物形态解剖学研究。

Abstract

In order to establish a simple， safe and rapid paraffin sectioning method to reduce the use of poisonous agent xylene in experimental process，the leaf and fruit of four periods of Ziziphus jujuba ‘Lingwu Changzao’were used as materials， and the anatomic features were observed by an improved low melting point polyester wax（Steedman’s wax） sectioning technique， and a set of feasible methods for paraffin sectioning preparation of plant tissues were established by improving embedding reagent， omitting the xylene transparence step， shortening the experimental processes， and compared it with conventional paraffin sectioning technique， it provided a new method for studying the plant tissues structures characteristics. The results indicated that the morphological structures of the leaf and fruit were complete and the staining was clear in paraffin sectioning obtained by the improved low melting point polyester wax（Steedman’s wax） sectioning method， the experimental procedures were not only simplified and the whole experimental time had been shortened， but also the quality of slices obtained using the improved sectioning technique was same as the conventional paraffin sectioning， and the experimental procedures were optimized and the use of toxic reagents such as xylene was avoided and experimental time was saved， and the efficiency of plant paraffin making was improved， it would be worthy of being used in more plant morphological anatomy research.

Graphical abstract

关键词

枣 / 低熔点多酯蜡 / 石蜡切片 / 解剖特征

Key words

Ziziphus jujuba / Steedman’s wax / paraffin sectioning technique / anatomy structure

石蜡切片方法应用和发展历史悠久，是植物解剖学、植物组织学、细胞学、发育生物学及分子生物学等研究中广泛应用的试验方法之一，为观察和研究植物器官、组织及细胞的有效方法，具有十分重要的地位^［1］。常规石蜡切片法通常以二甲苯（xylene）为透明剂和脱蜡剂，具有较好的效果，但有证据表明，二甲苯能够通过呼吸道和皮肤黏膜损害人体的神经和血液系统，引起神经衰弱和皮肤黏膜刺激等^［2］。近年来，国内外采用环保透明剂柠檬烯（C₁₀H₁₆）、Van-clear、正丁醇和松节油等代替二甲苯的做法也偶有报道^［2］。该方法虽可避免二甲苯的毒性危害，但柠檬烯和Van-clear对组织有一定的破坏作用，而正丁醇可造成组织结构断裂，同时透明效果较低，松节油也未能提供较好的透明效果，这些因素限制了该方法的普遍推广应用^［3］。

自Steedman^［4］在Nature上介绍低熔点多酯蜡（Steedman’s wax）以来，因其熔点为35~37 ℃，易溶于乙醇，具有与常规石蜡相同的切片性质，可制作厚度大于5 μm的连续切片，被应用于植物细胞微管骨架^［5］、植物细胞程序性死亡（PCD）^［6-7］和免疫荧光组化定位等特定方面的研究^［8］，而将Steedman’s wax代替常规石蜡应用于植物组织形态学的研究鲜见报道。传统石蜡切片法存在制片周期长，脱水、二甲苯透明和浸蜡时间过长易使材料变脆、变硬等较多制片难点^［9］，利用Steedman’s wax代替常规石蜡，可减少传统石蜡切片中二甲苯的毒性危害，优化试验过程。其次，传统石蜡切片方法耗时较长且操作过程繁琐，脱水、浸蜡、包埋、贴片、展片及染色等步骤尚具有可优化的空间^［2］。随着植物快速石蜡制片方法研究的发展，石蜡制片质量和效率均有所提高^［10］。虽然制片时间有一定缩短，但制片过程中需要的设备和试剂等条件提高^［10-11］。近年来，简便、安全且快速的石蜡制片方法成为本领域关注和探索的热点^［1-3］。针对以上问题，本研究以生长于干旱和半干旱地区的宁夏优良鲜食枣品种灵武长枣（Ziziphus jujuba ‘Lingwu Changzao’）的叶片和果实为试验材料，基于常规石蜡切片方法，通过探索性试验，拟对传统石蜡切片方法的试验时间相对较长、试验过程毒性较大等不足进行合理改良，形成改良的Steedman’s wax石蜡切片法，以期提高植物石蜡制片质量、缩短制片周期、简化程序和减少有毒物质。

1 材料与方法

1.1　试验材料

以位于宁夏灵武市的宁夏红枣工程技术研究中心试验基地（38°12′N，106°34′E）6年生灵武长枣的叶和果实为供试材料，随机选择生长发育良好、树势适中、长势相似、栽培管理水平一致的5~10株植株。用毛线于2023年6月10日标记同一天开放的花朵，在谢花后30、60、90、110 d共设计4次试验，每次试验时间均设定于09：00—11：00。从试验植株树冠的东、西、南、北4个方位及上、中、下、内、外各方向选择枣吊中部果实及附近的叶作为试验对象^［8］。

1.2　试验方法

1.2.1　改良的低熔点多酯蜡（Steedman’s wax）切片方法

1.2.1.1　低熔点多酯蜡（Steedman’s wax）的制备

参考Ovečka等^［12］的方法，熔点35~37 ℃石蜡Steedman’s wax由聚乙二醇-400二硬脂酸酯（购自Sigma-Aldrich，cat.#305413）和1-十六烷醇（购自Sigma-Aldrich，cat.#258741）按质量比9∶1熔化混合而成。先将聚乙二醇-400二硬脂酸酯放入烧杯中，在温箱中50 ℃左右完全熔化，然后加入1-十六烷醇熔融并搅拌充分混匀，室温下冷却而成熔点35~37 ℃石蜡Steedman’s wax备用^［8］，可反复回收过滤后利用。

1.2.1.2　取材与固定

选取不同发育时期的叶，用锋利的刀片将 叶片分割成含有3条主脉的长0.6 cm、宽1.0 cm的小块，不同时期果实切成带外果皮的0.6 cm× 0.4 cm×0.5 cm的小块，分别放入装有3~5 mL 3.7%甲醛固定液的玻璃小瓶中，抽气10 min左右至样品下沉瓶底，确保材料完全浸没在固定液中，室温固定4~6 h。迅速固定细胞，保存完整的细胞结构。

1.2.1.3　脱水

固定后的叶和果实样品经蒸馏水冲洗，用0.05% Toluidine blue（甲苯胺蓝）染色15 min，常温下依次用体积分数30%、50%、70%、90%的梯度乙醇脱水，每次60 min，100%乙醇3~4次，60 min/次。可通过摇床提高脱水效率。

1.2.1.4　浸蜡与包埋

脱水后的叶和果实样品用V（纯乙醇）∶V（Steedman’s wax）=1∶1的溶液在恒温箱中37 ℃渗透过夜，次日更换V（纯乙醇）∶V（Steedman’s wax）=1∶3的溶液在37 ℃渗透2.5 h，再用纯Steedman’s wax在37 ℃渗透3次，每次2~3 h。浸蜡的关键在于纯石蜡渗透前纯乙醇与Steedman’s wax体积比为1∶1、1∶3步骤，更加需要较长的渗透时间，与Ovečka等^［12］的方法中乙醇与Steedman’s wax体积比为2∶1、1∶1、1∶2步骤各1~2 h，而纯Steedman’s wax第1次2 h，第2次过夜不同。

浸蜡结束后，在较低温玻璃板上的牛皮纸盒中倒入适当高度的Steedman’s wax，待纸盒底层蜡液稍有凝固后迅速将样品用加热的镊子或解剖针移入包埋盒中摆放整齐包埋，室温下凝固即可。包埋时用的镊子、解剖针等只需用保温灯加热至37 ℃或以上即可。

1.2.1.5　切片、贴片和展片

根据研究目的，将蜡块修成上、下两边平行的正方形或长方形，然后将样品蜡块固着在小木块上，在25 ℃左右环境中，用LEICA RM 2255石蜡切片机将蜡块切成10 μm厚的切片，蜡带用毛笔取下后光面朝下放在较低温的瓷盘中。先在涂有0.2%聚乙烯亚胺粘片剂的载玻片上加1~2滴蒸馏水，用镊子或解剖针将蜡带光滑面朝下轻放在载玻片水滴中摆放整齐。切片在25 ℃左右室温下可自然展片^［8］，如展片不完全可再滴1~2滴蒸馏水即可，后吸去多余蒸馏水，晾干12 h后备用。

1.2.1.6　脱蜡、染色、封片及观察拍照

将干燥后的载玻片放入装有纯乙醇的染色缸中，中间换2次纯乙醇，30 min/次，切片即可全部脱蜡。将切片依次放入90%、70%、50%乙醇的染色缸中逐级复水，每级10 min。蒸馏水冲洗后，用0.01% Toluidine blue染色10 min，切片经蒸馏水冲洗稍微晾干后，取100%甘油封片剂少许滴在切片上用盖玻片封片，避免产生气泡，吸去多余的封片剂后用指甲油将盖玻片的四周封固，在OLYMPUS IX73显微镜下观察并拍照^［8］。

1.2.2　常规石蜡切片法

叶和果实样品在FAA固定液（V（70%乙醇）∶ V（35%~40%甲醛）∶V（乙酸）=90∶5∶5）中固定24 h以上，利用常规石蜡切片法^［13］切片，切片厚10 μm，切片经二甲苯脱蜡后复水至50%乙醇，1%番红（50%乙醇溶剂）染色4~16 h，梯度乙醇逐级脱水，0.1%固绿（95%乙醇溶剂）对染，彻底脱水后二甲苯透明，光学树胶封片，完全干燥后在显微镜下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1　Steedman’s wax法观察4个不同发育时期叶解剖特征的效果

4个不同发育时期灵武长枣叶均由表皮、叶肉和叶脉3部分组成。

表皮：叶上、下表皮均由一层排列紧密的细胞组成，细胞壁被染成淡蓝色。上表皮细胞较大，近长方形，垂直于叶片方向的细胞壁较薄，而表皮细胞外切向壁较厚，形成了较厚的淡蓝色角质层；下表皮细胞较小，方形，表皮细胞外切向壁同样形成了较厚的淡蓝色角质层；气孔器仅分布于下表皮，孔下室较大（图1A~1D）。

叶肉：叶肉由6~7层细胞组成，细胞壁被染成淡蓝色，靠近上表皮的叶肉组织由3层垂直于表皮的长柱状栅栏组织细胞组成，排列很紧密，内部有被染成淡蓝绿色叶绿体；近下表皮的叶肉组织主要由3~4层短柱状的栅栏组织细胞组成，垂直于下表皮，排列也较紧密（图1A~1B）。花后90 d叶肉栅栏组织排列更加紧密（图1C~1D）。因此，灵武长枣叶为典型的等面叶，具有较典型的旱生结构特征。

叶脉：灵武长枣叶具有3条发达的主脉，中间主脉维管束直径较大，两侧主脉维管束直径略小（图1A~1D）。主脉维管束木质部发达，导管和薄壁组织被染成较深的蓝绿色；形成层、韧皮部细胞被染成浅蓝色（图1A~1D）。维管束外为一圈卵圆形被染成深蓝色的维管束鞘结构（图1A~1D）。

主脉处上、下表皮内部为数层被染成浅蓝色的厚角组织和薄壁细胞，其中分布有数个分泌道（图1A~1D）。

在上、下表皮间的叶肉中间部位，分布着比较小的横切或纵切的侧脉和细脉，叶脉维管束结构较简单，最明显的是被染成深蓝色的维管束鞘（图1C~1D）。

2.2　Steedman’s wax法观察4个不同发育时期果实解剖特征的效果

花后30 d果实外果皮由单层被染成蓝绿色的细胞组成，外壁角质层被染成浅蓝色，紧邻外果皮的几层排列较为紧密的细胞被染成紫黑色，其内部数层中果皮薄壁细胞的细胞壁均被染成浅蓝色，大小不同的中果皮维管束分布较多，木质部导管通常被染成深蓝紫色或蓝绿色，韧皮部通常为浅蓝色（图2A）。

花后60 d果实外果皮细胞浅蓝色角质层明显增厚，紧邻外果皮的数层排列较为紧密的细胞被染成紫黑色，相比花后30 d细胞层数增多，其内部数层中果皮薄壁细胞的细胞壁均被染成浅蓝色，薄壁细胞中维管束分布较疏松，维管束木质部和韧皮部染色特征与花后30 d相似（图2B）。

与花后60 d相比，花后90 d果实内部薄壁细胞间隙拉大、拉长，排列松散，由于部分细胞破裂，中果皮空腔数量增多、体积增大，维管束数量相对较少，木质部导管通常被染成蓝紫黑色，韧皮部通常为深蓝色（图2C）。

由于大量细胞破裂，花后110 d果实中果皮形成了更大的空腔，同一视野下维管束数量更少，而维管束染色特征与花后90 d相似（图2D）。

2.3　常规石蜡切片法观察4个不同发育时期叶解剖特征的效果

4个不同发育时期叶均由表皮、叶肉和叶脉3部分组成。叶按常规石蜡切片番红-固绿双重染色显示，上、下表皮由被染成绿色排列紧密的细胞组成，具较厚的角质层（图3A~3D）。叶肉由被染成绿色、排列紧密的数层栅栏组织细胞组成，内部含很多深绿色叶绿体（图3A~3D）。叶脉木质部多列放射状排列的导管被染成浅红色，叶脉其他组织的细胞主要以绿色为主，维管束鞘细胞呈现浅绿色或部分细胞内部呈深紫色（图3A~3B）。

2.4　常规石蜡切片法观察4个不同发育时期果实解剖特征的效果

果实按常规石蜡切片番红-固绿双重染色显示，不同发育时期果实的中果皮薄壁细胞均被染成绿色（图4A~4D），其中分布的维管束木质部导管被染成红色，木薄壁细胞被染成绿色，韧皮部均主要以染成深绿色的细胞为主（图4A~4D）。

2.5　两种制片方法比较

2.5.1　制片操作步骤与周期比较

石蜡制片法步骤多，制作周期较长。由表1可见，2种方法在试验步骤和周期上有所不同，Steedman’s wax制片法在“固定、脱水、渗透、包埋、贴片和展片、染色”上进行了优化，对制片步骤进行合理安排，使得整个制片过程步骤简化、时间缩短，其全部试验只需48 h左右，仅为常规石蜡制片法的1/3左右，整体上提高了制片效率。

2.5.2 制片效果比较

石蜡切片中植物组织形态和结构是否完整，颜色是否鲜明是判断切片质量的主要指标^［13］。改良的Steedman’s wax切片法和常规石蜡切片法的处理结果表明：不同方法所制切片结构均较完整，然而叶片表皮细胞、叶肉和叶脉及果实各组织的结构完整性在不同方法间仍存在明显差异。改良的Steedman’s wax切片法制片组织完整、细胞界限清晰、颜色对比鲜明、切片干净（图1~2）；常规切片法因双重染色切片色彩鲜艳，由于二甲苯透明力强易穿透组织，二甲苯、高浓度乙醇和浸蜡时间过长均容易引起组织变脆、变硬，导致切片时部分细胞破碎、细胞界限不清晰，降低了切片质量，因此其透明等步骤需严格把握处理时间（图3~4）。结果表明，改良的Steedman’s wax切片法制片质量总体较好，与常规方法相比有较明显差别。

3 讨论与结论

3.1　固定和脱水方法优化

固定的目的是快速停止组织和细胞的生命活动，尽可能地保存材料原有的形态和结构，所以固定过程应使固定液尽快渗透进组织^［10］。甲醛是光镜水平下免疫荧光标记所使用的最好的固定剂，它能快速渗透进组织，收缩很少，能最大程度保存样品的原有结构，而Steedman’s wax的低熔点特点使其在免疫细胞化学上具有明显的优势^［5］。因此，本研究以3.7%甲醛作固定液，固定时间4 h左右，远低于常规石蜡切片FAA固定液所需的最短18 h固定时间，既缩短了固定时间，又不影响植物组织结构特征的观察效果，后期Steedman’s wax包埋后的切片也完全可以用于免疫细胞化学定位试验。当然，如果仅以研究植物组织结构特征为目的，固定液也可以更换为FAA^［9］，固定后脱水从70%或90%乙醇开始，还可通过摇床辅助脱水，增强脱水剂对组织的渗透能力，从而进一步提高脱水效率并减少脱水步骤，缩短脱水时间。

3.2　石蜡渗透过程优化

石蜡渗透是包埋剂石蜡逐步渗透浸入植物组织的渐进过程，以支撑整个组织并稳定其结构，因而该步骤至关重要，往往影响最终的切片质量。在传统的植物石蜡制片中，通常选用的是熔点60 ℃左右的常规石蜡，为了使石蜡渗入样品组织，脱水后的样品必须用二甲苯进行透明处理。二甲苯易挥发、具刺激性气味且毒性较大，同时也是一种可能的致癌物质，对试验人员的健康构成潜在危险。虽然可以在真空干燥箱中完成石蜡渗透，节省渗透浸入的时间，减少二甲苯等有毒化学气体污染^［10］，但这将提高石蜡切片制作对设备的需求，而且并没有消除二甲苯污染。以环保透明剂代替二甲苯的方法^［2］，消除了二甲苯在安全性方面存在的毒性隐患，但会对组织造成不同程度的破坏，产生组织结构断裂、透明脱蜡效果较差的不利影响^［3］。

Steedman’s wax的理化特性使其成为一种能够替代传统石蜡的新型包埋剂。由于其易溶于纯乙醇，所以样品经乙醇脱水后可直接进行石蜡渗透，切片染色时可直接用纯乙醇脱蜡，因而省去了透明环节，既节省了时间、优化了试验过程，也消除了二甲苯的毒性危害，石蜡制片过程省时且安全。不仅如此，由于整个石蜡制片过程在37 ℃左右条件下进行且不使用二甲苯，因而可应用于免疫学^［8］和细胞学^［7］方面的研究，应用范围更加广泛。Steedman’s wax制备过程简单，除以上优点外，可能不足之处主要是制备该石蜡的聚乙二醇-400二硬脂酸酯和1-十六烷醇价格比常规石蜡高，但一次购买后可反复回收利用，因而是植物材料石蜡切片的一种优良包埋渗透介质。

3.3　包埋方法优化

常规石蜡切片使用的是熔点60 ℃左右的石蜡，浸蜡结束后包埋时需要包埋台、镊子、解剖针等并以酒精灯加温避免包埋石蜡凝固，以保证在室温条件下包埋操作的正常进行。而Steedman’s wax蜡熔点为35~37 ℃，包埋时无需包埋台或石蜡包埋机，包埋操作时使用的镊子、解剖针等工具只需用保温灯加热至37 ℃左右即可。因石蜡散热和凝固慢，为加快包埋进度，可将包埋牛皮纸盒放在水平的较低温玻璃板上（也可在玻璃板下放平面冰板），室温下凝固即可。凝固后蜡块色泽清亮，质地坚硬且细腻，结构性良好，样品稳定性更高。包埋过程无需特殊设备，操作更加简单易行、安全。

3.4　贴片和展片方法优化

石蜡切片制作不仅与切片前的系列处理有关，而且与切片后贴片和展片的操作也紧密相关，贴片时必须将切片完全伸展。常规石蜡制片时需将载玻片置于45 °C烤片机上，烤片50~80 min^［1］；通常无展片器或贴片板的可在酒精灯上略加热，蜡片受热后慢慢伸直展平^［10］。但其过程较烦琐，初学者难以准确把握，非常容易因温度过高使切片熔化而失败。也有将切片蜡带浮于培养皿水面中，将载玻片一端浸入培养皿中并将蜡带轻轻位移到载玻片上^［2］。这种贴片和展片的操作方法也较烦琐，不便于掌握。本研究方法在贴片和展片时，由于Steedman’s wax的低熔点特性，切片在25 ℃左右室温下即可自然展片，晾干后蜡带牢固地粘贴在载玻片上。贴片和展片过程无需展片器或贴片板等特殊设备，操作简便。

3.5　染色程序优化

为优化Steedman’s wax切片法染色程序，本研究将干燥后的切片放入纯乙醇中溶蜡、脱蜡，免去了常规石蜡切片二甲苯脱蜡步骤，消除了二甲苯脱蜡的毒性影响，使切片染色环保安全。切片纯乙醇溶蜡脱蜡、梯度乙醇逐级复水后，经Toluidine blue染色、甘油封片剂封片、指甲油封固盖玻片，吹干即可马上观察拍照，免去了常规石蜡切片染色后需二甲苯透明再封片的步骤，消除了二甲苯透明的毒性影响；也免去了常规石蜡切片二甲苯溶解的中性树胶封片后需在干燥箱中烘干1~2 d方可观察、保存^［9］等步骤。本染色过程时间短，染色效果优良，染色过程简化、安全、环保。

番红-固绿染色是常规石蜡切片普遍使用的双重染色方式，切片脱蜡后复水方可染色。番红作为碱性染料不易着色，以水或低体积分数乙醇配制成1%左右，溶剂的最高体积分数通常不超过50%，可通过适当提高染色温度缩短染色时间^［13］，而过度缩短番红染色时间必然影响染色效果^［10］。而非常规的改用95%乙醇来配制番红，免去了大多数复水过程，虽精简了染色程序^［2］，但在一定程度上会影响染色效果。也有切片后不经过脱蜡直接放入1%番红水溶液中染色12 h以上，染好后的切片干燥后，依次浸入二甲苯脱蜡、1%固绿（95%乙醇溶剂）染色后脱水封片^［9］，一定程度上也影响了染色效果。所以，在制定番红-固绿双重染色方案中，番红（50%乙醇）-固绿（95%乙醇）可能是最佳简化程序。当然，以番红水溶液作为染色剂虽增加了后续的脱水步骤，但可能会增强番红的染色效果。如果想在染色程序方面进一步简化，最好的选择就是改变染色剂和染色方案，如切片经二甲苯、纯乙醇后仅进行固绿染色的固绿快速染色法^［14］，虽然染色步骤简单，整个染色过程可在 1 h内完成，但其固绿染液中含有毒物质甲醇，增加了试验的毒性和不安全性。

本研究针对常规石蜡制片的不足，通过改良固定、脱水、渗透、包埋、贴片和展片、染色等操作程序，优化了植物石蜡制片的操作流程，显著缩短了制片周期。根据Steedman’s wax的理化特性，本方法免去了常规石蜡制片中必要的透明步骤，脱蜡采用乙醇，从而根除二甲苯对操作者的危害，从根本上提高了试验的安全性。改良后的制片过程更加简易，便于初学者短期内熟练应用，并且无需组织脱水机、包埋机、展片台和烤片机、真空干燥箱等特殊设备。

石蜡切片方法被认为是组织学研究中的重要试验方法。然而常规石蜡切片方法存在试验时间相对较长、试验过程毒性较大、影响试验成败的因素较多等局限性。很多科研工作者针对此类问题对常规石蜡制片方法进行了改良，然而改良方案中对于二甲苯的毒性危害，仅强调在操作上缩短与有毒试剂接触时间、更换毒性略小但效果较差的透明剂等，并没有从根本上解决该问题。本研究提出的Steedman’s wax切片法，减少了有毒试剂的使用，删除了透明步骤，缩短了试验时间，简化了试验流程，为建立简便、安全、快速的植物组织切片方法提供了新思路。

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基金资助

国家级大学生创新创业训练计划项目(G202210749023)

宁夏自然科学基金项目(2022AAC03087)