空间转录组技术在植物研究中的应用及前景

Application and Prospect of Spatial Transcriptome Technology in Plant Research

摘要

空间转录组（spatial transcriptomics，ST）是一种用于从空间层面上解析RNA-seq数据的技术，利用该技术解析单个组织切片中的所有mRNA。空间条形码逆转录oligo（dT）引物在显微镜载玻片表面的有序附着，使得在mRNA样品处理和后续测序过程中编码和获取位置信息成为可能。与传统的转录组技术相比，空间转录组技术能获得细胞在组织原位环境下真实的基因表达特征，以及与微环境的关系，为基因表达提供高精度、高分辨率原位的空间信息。近年来，空间转录组技术取得了重要进展，检测的细胞通量、转录本数量和质量不断提高，空间定位信息更加准确全面，并已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、杨树（Populus）等植物中展开研究。该文阐述了空间转录组技术在植物动态发育轨迹、不同组织和细胞类型差异分析、解码植物与微生物群相互作用等研究中的成功应用，讨论了空间转录组测序在植物组织原位测序中存在的问题和挑战，揭示了其在植物研究中的巨大潜力，为相关领域的进一步研究和应用提供了新的视角。

Abstract

Spatial transcriptomics（ST） is a technique used to resolve RNA-seq data at the spatial level， thereby resolving all mRNA in a single tissue section. The orderly attachment of spatial barcoding oligo（dT） primers to the surface of microscope slides makes it possible to encode and obtain positional information during mRNA sample processing and subsequent sequencing. Compared with the traditional transcriptome technology， the spatial transcriptome technology can obtain the true gene expression characteristics of cells in the in-situ environment of tissues and the relationship with the microenvironment， and provide high-precision and high-resolution in-situ spatial information for gene expression. In recent years， the development of spatial transcriptome technology has made significant progress. The detected cell flow， the quantity and quality of transcripts are continuously improved， and spatial location information is more accurate and comprehensive. It has been studied in Arabidopsis thaliana， Oryza sativa， and Populus， etc. In this paper， the successful applications of spatial transcriptome technology in the study of plant dynamic development trajectory， the analysis of differences between different tissues and cell types， and decoding of the interaction between plants and microbial communities were described. The problems and challenges of space transcriptome sequencing technology in plant research were discussed， and the great potential of space transcriptome technology in plant research was revealed， which provided a new perspective for further research and application in related fields.

Graphical abstract

关键词

空间转录组技术 / 空间分布模式 / 发育谱系 / 细胞类型鉴定 / 细胞间相互作用

Key words

spatial transcriptome technology / spatial distribution patterns / developmental lineages / cell type identification / cell-to-cell interactions

了解植物组织中基因表达的空间分布模式，探索组织和细胞类型之间的差异，对于理解植物的发育和进化、植物与环境的相互作用及其他生物过程具有重要意义。传统的转录组测序^［1］是对多细胞组织进行的混合测序分析，得到的是一群细胞内基因表达的均值，由于单个细胞之间存在异质性，这样的数据丢失了细胞与细胞之间的差异信息。然而，单细胞测序技术^［2-3］需要进行细胞捕获、裂解和提取，在此过程中会导致空间位置信息丢失。不同细胞的空间位置信息对于揭示细胞之间相互作用至关重要，而细胞间的相互作用与组织发育和生理功能有着密切关系。因此，将基因表达与其细胞定位联系起来对于深入研究植物各组织基因时空表达至关重要，空间转录组（spatial transcriptomics，ST）技术应运而生。空间转录组技术^［4］能够结合成像和测序，提供细胞和组织级别的基因表达信息，并绘制出组织中特定转录本存在的位置，详细描述基因表达的空间分布模式，从而更加全面地从分子层面研究植物组织，为深入理解植物的发育和生理过程提供关键线索^［5］。

2020年和2022年，空间转录组技术被Nature Methods评为年度技术方法，进一步显示该技术具有巨大的发展空间^［6-7］。空间转录组技术的最新进展在研究基因表达空间分布、鉴定细胞类型、揭示细胞间相互作用等方面发挥了重要作用。虽然空间转录组已广泛应用于动物和人类研究，但在植物研究中的应用一直滞后。与动物相比，植物具有更复杂的组织结构，使得样品制备更具挑战性。此外，由于ST主要是为动物样本开发的，因此，在将该技术应用于植物组织时存在一定的限制。近年来，随着测序技术的不断发展，从空间角度研究植物组织特征成为可能，尤其是在鉴定细胞类型、重建细胞命运发育谱系、解码植物与微生物群相互作用、揭示细胞间相互作用方面开辟了重要应用。本文介绍ST技术的最新进展，重点阐述该技术在植物生物学中的应用成果。

1 空间转录组技术概述

作为一种新兴的基因表达分析方法，空间转录组技术的发展使研究单个细胞的异质性、构建空间转录组图谱成为可能^［8］。空间转录组技术在生物研究的各个领域具有广泛的通用性。近年来，大量空间转录组研究解析小鼠大脑、胚胎等各种动物器官的发育演变过程，展示了空间转录组在研究动物发育过程中的结构功能和调控机制的重要作用。此外，空间转录组技术在微生物研究中也具有重要的应用价值。在肿瘤研究中，不同类型的肿瘤组织在基因表达模式上存在差异，空间转录组技术能够探索肿瘤的组织异质性，通过研究其与正常组织边界的基因特征，揭示肿瘤发生、发展的分子机制。这对于肿瘤的预防、早期判断和治疗具有重要的指导意义。Rao等^［9］确定了已知的精神分裂症和自闭症相关基因的空间表达模式。在发育生物学中，时间分辨空间转录组图谱有助于阐明心脏发育的空间动态、精子发生和肠道发育。

空间转录组技术结合了高通量测序和组织学技术，首先对组织进行切片或解离，获得单细胞或组织的RNA，将RNA转录成cDNA进行测序。与传统的测序方法不同，空间转录组技术能够将基因表达信息与组织结构信息配对结合，确定每个基因在组织和细胞水平上的表达模式，在空间背景下了解细胞异质性，帮助了解植物的组织和器官发育过程^［10-11］。根据获取RNA空间位置信息的方式不同，空间转录组技术可以分为3种类型：基于激光捕获显微切割（LCM）的方法、基于荧光原位杂交的方法和基于原位捕获测序的方法。激光捕获显微切割从混合样品中分离出特定的细胞，然后对相关组织进行基因表达分析，这种方法包括专为单细胞转录组学开发的全长mRNA测序（LCM-seq）^［12］和地理位置测序（Geo-seq）^［13］，可成功获得单个细胞的空间转录组，但由于切割步骤过多和低通量而具有挑战性。基于荧光原位杂交的方法需要将DNA探针与RNA分子进行原位杂交，利用高分辨率显微成像，直接对细胞内RNA进行定量检测，同时保留其空间位置信息，包括FISSEQ^［14］、MERFISH^［15］、osmFISH^［16］、BaristaSeq^［17］和STARmap^［18］，在很大程度上增加了可检测区域，实现了较高的空间分辨率，但它们的通量和灵敏度会受到组织大小的限制。原位捕获测序方法通常利用空间条形码捕获相应细胞的mRNA进行逆转录，进行非原位测序，获得转录本和位置信息。该方法包括视觉空间转录组测序技术（Visium）、高清空间转录组测序技术（HDST）^［19］、基于原位捕获的高通量空间转录组技术（Slide-seq）^［20］、确定性条形码的高空间分辨率多组测序技术（DbiT-seq）^［21］、随机条形码单分子寡核苷酸的固相扩增测序技术（Seq-Scope）^［22］和空间增强分辨率组测序技术（Stereo-seq），可以在更大的组织切片水平直观地观察到基因表达的丰度，但其费用较高（表1）。已有前人^［23］从分辨率、基因捕获率和组织捕获面积等方面详细介绍了这些方法的特点。本文重点介绍空间转录组技术在深入研究植物发育过程及理解植物与微生物群相互作用方面的应用。

2 空间转录组在植物研究中的技术流程

利用空间转录组技术对植物进行研究，需要经过新鲜组织处理、样品制备、样品检测、组织优化、文库构建、测序等步骤。样本制备是空间转录组试验中的一个重要环节。将新获得的组织样本快速冷冻，防止RNA降解，避免可能导致组织形态学损伤的晶体形成。样本冷冻后立即使用最佳切削温度组分（optimal cutting temperature compound，OTC）包埋以保持组织结构，进行冷冻切片。通过对置于载玻片上特定捕获区域内的冷冻切片进行染色和拍照保留样本的组织形态学信息，然后对同一样本进行通透化处理，使得样本的RNA解交联，与捕获区域内的寡核苷酸探针杂交，捕获切片中的转录本信息。后续进行切片的建库测序和分析工作（图1）。

2.1　植物样品制备

空间转录组试验植物样品制备通常包括以下步骤：新鲜组织取样、冷冻包埋、冷冻切片、组织染色、组织优化、文库测序和数据分析。由于植物样品的复杂性和多样性，因此，取样、低温包埋和低温切片的方法要根据组织类型进行调整和优化。首先，将新鲜组织包埋到OCT介质中。对于含水量高的组织，可用多聚甲醛（PFA）作为包埋剂，然后进行蔗糖、甘油或液氮冷冻保护，以防止低温包埋过程中的冰晶形成和植物形态丧失。在植物组织冷冻切片时可以用恒温冷冻切片机切片，同时应考虑组织的木质化程度和细胞形状，根据试验者需要进行切片。例如，薄片用于相对幼嫩的组织，如花、叶片和茎尖，而宽薄片用于相对成熟的组织，如根。此外，纵向细长的根细胞采用纵向切片更容易，组织染色可以用甲苯胺蓝、苏木精和伊红等。植物组织中的次生代谢物会影响mRNA捕获，可以通过添加与次生代谢物结合的抑制剂从组织切片中消除。尽管冷冻切片技术在ST中得到了广泛的应用，但其在植物组织中的大规模应用仍然有限。在样品制备时，需要选择合适的包埋手段及染色方法。组织切片的空间成像图可以与空间转录组相结合，以探索细胞在组织内如何相互作用及特定基因在哪里表达。

2.2　数据处理和分析

预处理^［24-25］作为数据分析的第一步，将原始图像或原始测序数据转变为可解释的空间转录组数据，预处理中的一个关键步骤是对识别的转录本进行空间分割，以生成特定细胞的转录组文件。在动物组织中，可以从核染色中推断出细胞中心来实现分割，但是精确分割很难实现。另一方面，植物细胞被细胞壁包围，细胞壁染色或细胞壁自发光可以帮助确定细胞边界，识别组织结构域和特征。基于这一特性，可以为植物量身定制单细胞分割算法。

为了更全面地了解影响植物细胞、组织、器官结构和发育的转录变化，在整个植物背景下进行细胞和亚细胞结构的可视化，尤其是3D和高分辨率的可视化^［26］成为关键。目前，大多数空间转录组技术涉及将组织切片图片与来自空间转录阵列的空间分辨基因表达数据叠加，提供全方位的空间基因表达。然而，创建3D时空地图集需要优化计算方法。空间转录组技术的应用往往涉及大量且高复杂性的基因表达数据，这些数据包含了大量的转录本信息及其在不同组织或细胞中的表达水平。处理这些大规模数据也需要借助强大的计算能力和高效的算法，以便从中提取有用的信息和模式。

整合多组学数据将有助于在多组学水平上表征基因调控，为了解植物细胞在发育和进化过程中的自发分化和进化提供新的见解。例如，整合scRNA-seq和ST数据可以增加基因捕获，并能够在单细胞分辨率下识别组织内的特定细胞类型和空间位置，从而更好地了解特定细胞类型在特定空间情景下的相互作用。因此，开发和优化数据集成算法，建立标准化的植物空间单细胞基因数据库是未来研究的迫切需要。

数据解析的困难还体现在数据的解释和分析上。由空间转录组技术得到的数据通常是一个巨大的基因表达矩阵，其中包含了大量的基因和样本，需要运用统计学和机器学习等方法，从数据矩阵中挖掘出基因表达模式、识别差异表达基因、发现共表达基因等，从而显著提高数据处理的效率和准确性。将这些分析结果与植物的生理特征和功能进行关联，可以更好地理解植物的转录调控网络和基因功能。充分利用这些策略和方法，可以更好地挖掘和解释空间转录组数据中的植物基因表达信息，为空间转录组技术提供更深入的理解和更广阔的应用前景。

2.3　技术标准与适用性

在空间转录组技术应用过程中，还存在一些技术标准与适用性的限制。空间转录组技术的适用性受到样本数量和质量限制。样本数量不足可能导致数据准确性和可靠性降低，从而影响对植物基因表达的全面了解。此外，样本质量也会对结果产生一定影响。植物组织与动物组织在结构上存在很大差异，特别是植物组织存在较硬的细胞壁及含水量很高的大液泡等结构，常规冷冻后的植物组织器官硬度大，形成的冰晶多，因而不易获得高质量切片^［27］。对于含水量高的组织，可以使用多聚甲醛（PFA）作为包埋剂，然后使用蔗糖、甘油或液氮冷冻保护，以防止冰晶的形成和低温包埋过程中植物形态的损失^［28］。在对植物进行冷冻切片时，既要考虑组织的木 质化程度，也要考虑细胞的性状。需要根据不同类型的样本，选择不同的切片厚度。尽管冷冻 切片技术在空间转录组技术中得到了广泛应用，但在植物组织中的大规模应用仍然有限。此外，在进行组织优化时，由于植物组织结构木质化程 度不同，RNA含量偏低，植物组织的RNA透化 难度加大。可以通过植物组织透化试剂，使用组合酶确保RNA被完全透化，解析植物组织空间位置所有RNA表达。因此，开发适用于植物的切片技术将大大降低与植物样品处理相关的技术限制，加速在植物研究中的广泛应用。加强样本质量控制和标准化操作，改进数据分析和解读方法，加强与其他技术的整合和综合分析，可为空间转录组进一步在植物研究中的应用提供有力支撑。

3 空间转录组技术在植物研究中的应用

传统的植物研究主要依靠观察、试验和统计分析来获取植物的相关信息，这种方法存在着很多限制和局限性，如样本数量有限、研究周期长等。因此，科学家们开始寻求更先进的技术来解决这些问题。随着生物信息学和计算生物学的发展，基因组学^［29］和转录组学^［30］等高通量测序技术也逐渐应用于植物研究中。这些技术可以大规模获取植物基因组和转录组的信息，识别出重要的DNA序列，并利用大数据和人工智能等技术，分析植物基因中存在的共同模式和规律，揭示植物在不同生长发育阶段和环境条件下的基因表达变化，这为研究植物的生长发育、逆境响应等提供了强有力的工具和手段。然而，这些技术大都展示的是不同组织间的差异表达，忽视了不同细胞类型的转录表达差异。

2020年以来，空间转录组技术开始成为植物研究中的热点技术。植物组织或器官内部存在细胞与细胞之间、细胞与周围环境之间的紧密联系，细胞所处的空间位置决定了其分子特性和功能。通过空间转录组技术可以获得植物的时空图谱，揭示植物基因的空间表达模式，深入了解植物发育、环境响应和病理学等方面的调控机制。到目前为止，空间转录组技术在植物研究中主要应用于重构细胞发育谱系、不同组织和细胞类型注释和细胞间通讯等，为研究植物的发育机制及其与其他生物的相互作用提供极为有价值的时空异质性信息（图2）。目前，空间转录组技术在模式植物，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和杨树（Populus）中已有广泛应用（表2）。

3.1　重建细胞命运发育谱系

在植物发育过程中，细胞分化并发育成各种细胞类型，最后形成功能特异的组织和器官。重建这些细胞的发育轨迹对于揭示调控植物命运的关键机制至关重要。通过对植物不同组织、不同器官及不同细胞类型进行空间转录组测序，同时记录转录异质性和细胞空间坐标，对细胞命运的发育谱系进行空间重建，可以更好地理解植物的生长发育过程。

以往研究^［37］利用组织化学染色、原位杂交、微阵列和大量细胞RNA测序（bulk RNA-seq）等方法在组织水平分析靶基因的空间表达特征，发现了调控生长发育的关键基因。此外，应用激光捕获显微切割（LCM）^［38-41］、流式细胞分选（FACS）^［42-43］、细胞核分选（INTACT）^［44］等，以及在单个细胞类型中标记细胞核分离技术^［45］与大量RNA测序相结合，探索选定细胞类型中靶基因的空间表达。然而，上述方法灵敏度不足，难以深入探索高度细胞异质性组织中的调节机制。

利用空间转录组技术能同时记录细胞的转录异质性和空间坐标，使细胞命运发育谱系的空间重建成为可能。大量研究结果表明，可以对植物不同组织进行空间转录组测序。Zhang等^［46］使用高通量单细胞RNA测序分析，发现拟南芥根组织中的细胞转录组具有高度异质性，但只能在单细胞分辨率下识别根细胞分化过程的中间状态表达特征。此外，在杨树中，空间转录组提供的区域基因表达信息验证了杨树茎次生维管组织中存在 2个干细胞活性中心，拟时序分析表明，这两类干细胞群都来源于初生维管组织中的原形成层，最终分别分化为韧皮部和木质部。Liu等^［47］利用空间转录组技术分析兰花（Cymbidium ssp.）数千个与花发育相关基因的空间表达分布，清晰描绘了分生组织细胞向营养细胞和生殖细胞的分化轨迹，揭示了花分生组织不同的细胞命运谱系。

利用空间转录组技术可对不同器官进行测序。Liu等^［47］利用空间转录组技术研究兰花的花器官发育过程。Du等^［48］利用Visium方法重构了杨树茎初生和次生生长中形成层细胞的发育轨迹，为植物生长发育过程和相应功能探索提供了高分辨率的空间基因表达模式，并为未来研究维管组织发育和陆地维管植物进化提供资源。Guo等^［49］利用Visium平台上的空间转录组（stRNA-seq）和单核转录组（snRNA-seq）技术，获得了毛竹（Phyllostachys pubescens）茎发育3个早期阶段基因表达的时空族谱。通过比较不同发育阶段数千个基因的动态变化，确定了调控毛竹分生组织维持和分化的关键因素，为进一步研究单子叶植物干细胞功能分化和器官发生的复杂调控网络提供了宝贵资源。

利用空间转录组技术能够鉴定细胞类型。Liu等^［47］利用空间转录组技术高分辨率地识别了兰花早期发育的多种细胞类型，并从中鉴定到一些可能的调控基因。2024年，Zhang等^［50］、Song等^［51］利用ST立体测序技术分析了番茄（Solanum lycopersicum）茎再生过程中整个愈伤组织单个细胞的分子特征。立体测序是由北京基因组研究所（BGI）开发的一项ST技术。该研究组使用单细胞/单核RNA测序（sc/snRNA-seq）和其他技术创建了番茄茎再生过程中详细的空间转录组图谱，通过分析，确定了7个不同的细胞簇，揭示了绿色组织细胞及参与茎原基形成的分子信号通路。Wang等^［52］利用空间增强分辨率组测序（Stereo-seq）构建了发育中的玉米穗原基的精确空间转录组图，鉴定了12种细胞类型，其中4种是主要在分化分生组织中发现的新分化细胞类型。通过提取分生组织成分进行详细聚类，鉴定了3种分生组织亚型，并验证了2个MADS-box基因在特定的分生组织的顶端特殊表达。

由此可见，利用空间转录组技术可以全面、准确地了解基因在植物不同组织、不同器官及细胞类型中的空间表达模式，从而揭示基因的功能和调控机制。这项技术为细胞命运发育谱系构建提供了强有力的技术支撑，并展现出在构建植物发育图谱方面的巨大潜力。

3.2　实现不同组织和细胞类型差异分析

将细胞分为不同类型可以更详细地了解组织功能和相互作用，揭示不同状态下的分子调控机制。对新鲜冷冻组织中的总mRNA进行测序，同时使用独特的条形码将这些转录本映射到它们相应的组织位置，以识别空间基因表达模式。一直以来，生物学家致力于分析多细胞生物的细胞动力学并破译复杂组织的细胞组成。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术^［53］的进步使得可以通过成千上万个单个细胞的转录组状态快速识别细胞类型，并定义罕见的细胞类型^［54-55］。虽然该技术在揭示细胞异质性方面取得了显著进展，但在没有已知标记基因的情况下注释细胞类型仍然具有挑战性。而空间转录组技术可以利用细胞在组织中的空间位置信息进行转录组分析，以灵活的方式在组织原位绘制细胞的转录组特征，解析细胞类型和信号通路，从而突破这一限制。

空间转录组技术可以对不同的植物组织细胞进行分析。Xia等^［56］利用scStereo-seq提取拟南芥单个细胞，并根据细胞壁甲苯胺蓝（toluidine blue，TB）染色和空间组织学信息对细胞类型进行分类，成功描述了叶片上、下表皮间细微但是显著的转录组差异。利用高分辨率的定位信息将叶肉细胞区分为栅栏细胞和海绵细胞，将表皮细胞区分为上表皮细胞和下表皮细胞。基于对不同组织或细胞中的基因表达空间信息检测^［57］，绘制非模式植物花生（Arachis hypogaea）茎部空间基因表达图谱，解析了花生果含有的不同细胞类群及每个细胞类群的空间位置信息，明确不同组织含有的细胞类型。Moreno-Villena等^［58］通过激光显微技术对不同环境马齿苋（Portulaca oleracea）叶片进行切割区分，获得叶肉、叶鞘及水分贮藏细胞，结合空间转录组测序及叶片组织区分，揭示了叶肉细胞和叶鞘细胞中C4途径及景天酸代谢途径（CAM）相关的基因表达差异，并建立了流量平衡模型，预测了干旱条件下C4和CAM系统的完整性，这些发现为研究C4植物光合作用途径提供了一个全新的视角。在玉米（Zea mays）籽粒研究方面，Wang等^［52］对W64A玉米近交系玉米籽粒灌浆阶段进行了微观切片和空间转录组分析，识别出11个细胞群和332个分子标记基因。此外，还系统地阐明了淀粉、蛋白质和油在玉米籽粒中主要物质的空间储存机制，提出了一个全面的空间组织细胞图谱，鉴定了基底胚乳转移层（胚乳-BETL）、胚胎周围区（胚乳-esr）和邻近胚乳（胚乳-eas）的细胞群^［59］。Jiang等^［60］通过时空转录组学研究了长雄野生水稻根状茎和分蘖中不同组织的表达谱，将2个空间上相互作用的细胞簇、维管束2簇和薄壁组织细胞2簇，确定为根状茎和分蘖的主要区别。在位于节间基部的薄壁组织凹陷区捕获了分生组织起始细胞，这是根状茎起始的起点。轨迹分析进一步表明，根茎是通过新生代再生的。综上所述，这些分析揭示了根状茎起始阶段的时空转录转变，为未来生物育种提供了宝贵资源。

值得注意的是，单细胞组学技术在许多方面促进了空间转录组学的发展，例如，可以从细胞分型提供标记基因，反过来又可以利用空间位置信息协助单细胞组学区分亚群。空间转录组技术可以精确分析植物的组织结构，鉴定不同植物细胞类型，为构建更精细的发育图谱提供强大的技术支撑，这将在植物发育生物学研究中发挥重要作用。

3.3　解码植物与微生物群的相互作用

微生物群落在植物组织中定殖，并能给植物宿主带来适应度优势，包括促进生长、吸收养分、承受压力和抵抗病原体。植物在自然环境中通过各种直接和间接机制与多种微生物群（包括细菌、真菌、病毒）相互作用，这些相互作用对于促进植物生长和保护植物免受生物和非生物胁迫至关重要^［61］。scRNA-seq可用于研究单个植物细胞对共生感染的反应，揭示细胞类型特异性的基因表达，但不能分析整个组织中的基因表达，而ST能够分析组织内固定位置的单个细胞，提供基因表达的物理位置，对于研究植物-微生物群相互作用、区分有益相互作用和有害相互作用及了解它们在植物发育和进化中的作用至关重要。

空间转录组技术可以识别共生组织中细胞之间的异质性。例如，大豆（Glycine max）-根瘤菌（Rhizobium）相互作用产生的固氮结节具有高度异质性，传统方法无法区分特定的细胞特征和结节内不同类型细胞的功能，而空间转录组技术可以使用包含特定根瘤菌序列的捕获探针直接获得感染根瘤菌的细胞类型。在大豆与根瘤菌相互作用的研究中，应用snRNA-seq和Stereo-seq在内的空间转录组技术^［62］，通过原位区分感染、未感染和其他细胞类型，基于空间信息构建大豆根瘤和根的空间分辨单细胞核转录组图谱，揭示大豆根瘤成熟过程中基因表达动态，为理解根瘤菌-豆科（Leguminosae sp.）植物共生提供新视角^［63］。Serrano等^［64］利用scRNA-seq和ST，在细胞和空间分辨率上研究了丛枝菌根（AM）真菌共生中苜蓿（Medicago sativa）和不规则蛇根草（Ophiorrhiza）的转录组，空间单细胞图谱显示了受感染和未受感染的植物根细胞类型。研究发现，皮质细胞在AM真菌定殖的不同阶段表现出不同的转录组特征，揭示了在细胞界面建立过程中，2种生物之间存在成功的共生作用。此外，Saarenpää等^［65］开发了一种改进的Visium空间方法——空间元转录组学（spatial metatranscriptomics，SmT），可以同时从植物组织切片中捕获真菌、细菌和宿主基因表达信号，同时保留空间组织信息。SmT通过从共存的有机体中捕获信息，扩展多模态空间测量范围，有望解开微生物种群和它们的植物宿主之间的复杂关系。

空间转录组技术可用于分析植物对病原菌感染的免疫反应。此前，对稻瘟病、纹枯病、褐斑病和细菌性枯萎病等的研究，已成功发现了调控植物对病原体免疫反应的诸多因素^［66］。然而，对于哪些细胞类型容易被病原体感染，以及它们如何将这些信息传递给周围细胞以触发免疫反应并不了解。此外，空间转录组可以显示感染和未感染细胞的空间相对位置和相邻细胞间的通讯，从而揭示细胞间免疫信号传递背后的机制。随着空间转录组技术的不断发展，该技术将在植物细胞与微环境的相互作用、植物细胞与病原菌的相互作用及植物细胞对各种非生物胁迫的反应机制研究方面发挥越来越重要的作用。

4 结语及展望

目前，亟需对已有的植物单细胞和ST数据库进行标准化管理，将最新的端粒至端粒的完整基因组组装（telomere-to-telomere，T2T）基因组、基因注释和来自多个物种的ST数据以标准化格式呈现各个发展阶段，推动大规的植物空间组学研究。空间转录组技术与单细胞测序的快速发展正在推动植物研究进入新时代，通过揭示空间特异性转录组特征、鉴定细胞类型、重建细胞命运发育谱系和解码细胞间相互作用，为植物生物学提供新的见解。

但由于植物材料特殊的生理特性，目前面临的试验（组织切片的制备，RNA捕获）、计算（处理固有噪声，空间表达图谱的可视化）和技术方面的挑战使其在植物界的应用远远落后于动物界。试验方面，植物组织冷冻包埋不同于动物组织的冷冻包埋，植物组织结构上跟动物组织存在很大差异，特别是植物组织存在较硬的细胞壁及含水量很高的大液泡等结构，不易获得高质量的切片。此外，细胞壁还影响了RNA的捕获效率^［67］。一些基于原位杂交技术的空间转录组方法中，细胞壁可能会阻止杂交探针与RNA的充分结合。一些植物组织可能存在较高的RNA酶活性，这会导致在空间转录组试验过程中RNA的降解，最终会影响RNA的质量和后续的转录组分析结果。计算方面，其中一个挑战是固有噪声。从计算的角度来看，空间数据中的技术噪声源于“空间丢失”。空间转录组学的主要优势是能够在植物组织切片的二维空间轮廓内实现基因表达动态的可视化，三维空间的可视化可以通过堆叠多个二维组织切片来实现。技术方面，植物细胞中存在大量低丰度的RNA，空间转录组技术在检测低丰度RNA时可能存在局限性。由于技术的灵敏度限制，这些低丰度RNA可能无法被准确检测到，从而影响对植物细胞中复杂基因调控网络的全面理解^［68］。此外，植物基因组注释仍存在不完善的地方，基因组注释不准确会影响对空间转录组数据的解读。

空间转录组技术已在植物研究中取得显著进展。但由于植物样本的复杂性和多样性，空间转录组需要在取样方法、定制单细胞分割算法、构建植物综合参考数据库等方面进行优化。同时，当前空间转录组技术仍然面临着分辨率低、灵敏度低、通量低及样品制备技术限制等挑战^［68］。未来，提高空间转录组技术的分辨率、灵敏度及捕获效率将有利于构建更完善、精细的单细胞空间转录图谱。

综上，空间转录组技术在植物研究中有着巨大的应用潜力，可进一步提高细胞的空间信息，由此更好地解析植物基因表达的空间特异性。不断加强该技术与其他技术的融合和交叉应用，将单细胞转录组学、空间转录组学、空间蛋白质组学和空间代谢组学技术等多组学技术联合，在单细胞水平上研究植物组织的转录组和代谢组，从而能够系统地研究特定发育阶段特定组织和细胞类型的基因表达和代谢。因此，利用空间多组学对复杂生物系统进行多维度解析，具有巨大的科学意义和应用潜力。最近，植物多尺度细胞分割技术的发布，极大地提高了植物细胞分割的准确性。目前，空间多组学的应用还处于初步阶段，在技术和方法方面仍存在一些困难有待克服。例如，scRNA-seq技术可能会遗漏弱表达基因，需要一些方法来消除批处理效应，从而解决跨数据集的技术混杂因素问题。专业的分析工具、算法和试验技术不断发展完善，将会加速推进植物时空组学技术的应用和科研转化，为探索植物发育和功能基因研究提供更加丰富的信息和新的思路，为未来的植物科学研究和农业发展做出积极的贡献。

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基金资助

中国林木种子集团合作项目(2024-HXFW-168)

北京林业大学“5⋅5工程”科研创新团队项目(BLRC2023C06)