外源黄酮对红松胚性愈伤组织增殖和体胚发生的影响

Effects of Exogenous Flavonoids on Embryogenic Callus Proliferation and Somatic Embryogenesis of Korean Pine

摘要

黄酮在植物体胚发生过程中扮演重要角色。为了探究黄酮对红松（Pinus koraiensis）体胚发生的作 用效果，该研究以红松胚性愈伤组织为试材，通过添加不同浓度、不同种类黄酮（槲皮素、柚皮素、儿茶素）及苯丙氨酸解氨酶（PAL）抑制剂2-氨基茚满-2-膦酸盐酸盐，测定处理后胚性愈伤组织增殖率、体胚数量及氧化胁迫相关指标变化。结果表明：胚性愈伤组织的增殖率随着外源黄酮浓度的升高逐渐降低，而体胚诱导数量先升高后降低，体胚产生数量在20 μmol⋅L^-1的外源黄酮处理下达到最高。黄酮能够降低胚性愈伤组织中总活性氧水平（ROS）、过氧化氢（H₂O₂）和丙二醛（MDA）含量，升高超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽过氧化物酶活性（GPX）。综上所述，外源黄酮主要通过影响胚性愈伤组织氧化胁迫水平，调控细胞增殖及胚性愈伤组织分化进程，促进红松体胚形成。

Abstract

Flavonoids play important roles in plant somatic embryogenesis. In order to explore the effect of flavonoids on somatic embryogenesis of Korean pine（Pinus koraiensis）， the embryogenic calluses were used as materials. The proliferation rate of embryogenic callus and the number of somatic embryos， and oxidative stress indexes in embryogenic callus were assessed after adding flavonoids（quercetin， naringenin， catechin） in different concentrations and phenylalanine aminolytic lyase inhibitor（2-aminoindan-2-phosphonate hydrochloride）. The results showed that the proliferation rate of embryogenic callus was significantly decreased with increasing levels of flavonoids， while the number of somatic embryos induced increased first then decreased， and the number of somatic embryos reached the peak under the treatment of exogenous flavonoids at 20 μmol⋅L^-1. After treatment with flavonoids， the total reactive oxygen species（ROS） level， hydrogen peroxide（H₂O₂） content and malondialdehyde（MDA） content were reduced in embryogenic callus； the superoxide dismutase（SOD） activity was increased； the catalase（CAT）， peroxidase（POD）， ascorbate peroxidase（APX） and glutathione peroxidase（GPX） activities were decreased. In summary， exogenous flavonoids might regulate cell proliferation and callus differentiation by affecting the level of oxidative stress indexes in embryogenic callus， hence， promote the formation of somatic embryos of Korean pine.

Graphical abstract

关键词

红松 / 胚性愈伤组织 / 黄酮 / 体胚发生 / 氧化胁迫指标

Key words

Pinus koraiensis / embryogenic callus / flavonoids / somatic embryogenesis / oxidative stress index

体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis，简称体胚发生）具有植株再生率高、胚胎结构完整、繁殖速度快等优点^［1］。体胚发生技术体系对优良种质材料的快速大规模繁殖和胚胎发育生物学研究等均具有十分重要的意义^［2］。红松（Pinus koraiensis）为松科（Pinaceae）松属（Pinus）高大乔木树种^［3］，是东北地带性植被阔叶红松林的建群种，具有重要的生态价值、经济价值和社会价值^［4-5］。为了建立红松优良种质材料规模化快繁体系，本研究团队前期建立了基于红松未成熟种子外植体的胚性愈伤组织诱导和成熟培养体系，突破了红松体胚和植株再生技术瓶颈，并对体胚发生体系进行优化和生理生化特性解析^［6-12］；但目前仍存在胚性愈伤诱导率低、愈伤组织在长期继代中分化困难、成熟体胚萌发成苗畸形率高等问题，导致胚性愈伤组织成熟培养和体胚转化体胚苗成为体胚发生途径建立快繁育苗技术的生物学瓶颈。

黄酮是植物特有的次生代谢产物，主要参与植物的色素沉积、抵御生物和非生物胁迫、生长素运输和信号传导等过程，同时也具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、改善血液循环等生理功能^［13-14］。黄酮生物合成途径是苯丙氨酸代谢途径的分支，其中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是苯丙氨酸代谢途径的关键限速酶，而2-氨基茚满-2-膦酸盐酸盐（2-Aminoindan-2-phosphonate hydrochloride，AIP）是PAL的特异性抑制剂。研究^［15］表明，对新疆紫草（Arnebia euchroma）悬浮 细胞进行AIP处理可特异性降低PAL活性，从而实现对苯丙氨酸途径代谢流的调控。目前，有研究^［16］表明，黄酮在胚性愈伤组织（embryogenic callus，ECs）中显著积累，并且激活类黄酮生物合成途径，能够促进细胞去分化，影响愈伤组织形成及分化。与其相似的是，Peng等^［17］通过对高胚性及经长期继代胚性降低的材料进行转录组及代谢组分析发现，黄酮在高胚性愈伤组织中高度积累，并且相关黄酮合成基因的表达水平也较高。

因此，解析黄酮类物质对红松体胚发生的影响及作用机理，可能会破除体胚诱导和成熟的技术瓶颈，对建立高效调控体胚发生体系具有重要理论和实践意义。基于以上考虑，本研究以经长期继代胚性降低的细胞系为试材，通过外源黄酮处理后，测定愈伤组织增殖效率、体胚形成数量及氧化胁迫相关生理指标变化，筛选适宜其分化的最优处理浓度，为优化红松体胚发生技术体系提供理论参考。

1 材料与方法

1.1　胚性愈伤组织材料获取及培养方法

以2021年于吉林省露水河林业局（42°24′~42°49′N，127°29′~128°2′E）红松种子园采集的未成熟球果为外植体诱导胚性愈伤组织，选取继代培养9个月的愈伤组织进行后续黄酮处理。增殖继代培养基配方：mLV中添加2.0 mg·L^-1 2，4-D、0.5 mg·L^-1 6-BA、25.0 g·L^-1蔗糖、0.5 g·L^-1酸水解酪蛋白、0.5 g·L^-1 L-谷氨酰胺、4.0 g·L^-1结冷胶。所有培养基在灭菌前调pH至5.8；经121 ℃高压灭菌30 min后，（25±2） ℃条件下暗培养。

1.2　胚性愈伤组织外源黄酮处理及增殖培养

将愈伤组织置于以下不同处理的增殖培养基中继代培养。本研究共设置21个处理，分别 为槲皮素（Q）、柚皮素（N）、儿茶素（C）、2-氨基 茚满-2-膦酸盐酸盐（AIP）浓度均为0、5、10、20、50、100 μmol·L^-1，其中0 μmol·L^-1为未添加黄 酮的对照（CK）处理。每个处理共3皿，每皿分别放3团0.1 g新鲜的愈伤组织，设置不同培养时间（3、5、7、14 d），在培养到设定时间时称鲜质量，随后将愈伤组织放回继续培养至第14天。愈伤组织增殖率计算公式：红松胚性愈伤组织增殖率=（增殖后胚性愈伤组织鲜质量-初始接种的胚性愈伤组织鲜质量）/初始接种的胚性愈伤组织鲜质量×100%。

1.3　体胚成熟培养

选取在黄酮及AIP处理下生长7 d的愈伤组织进行体胚成熟转化。成熟培养基采用mLV+0.02 g·L^-1 ABA+12.00 g·L^-1结冷胶+68.00 g·L^-1蔗糖+0.50 g·L^-1酸水解酪蛋白+0.50 g·L^-1 L-谷氨酰胺，每个处理取0.35 g愈伤组织加入15 mL含有25 g·L^-1蔗糖的mLV液体培养基中悬浮，混匀，抽取3 mL含有胚性愈伤组织的悬浮液均匀转移至布氏漏斗中的无菌滤纸上，利用抽滤瓶和真空泵抽出多余液体培养基后，将带有愈伤组织的滤纸再转移至成熟培养基中，在黑暗（25±2） ℃条件下培养8周，期间不进行继代培养，每个处理重复5次。利用体视显微镜（Olympus SZX-ILLB2-200，日本）观察不同处理材料体胚形态，统计每克胚性愈伤组织鲜质量的体胚发生数量，计算公式：每克胚性愈伤组织的体胚发生数量=体细胞胚胎的发生数量/成熟培养前胚性愈伤组织的鲜质量。

1.4　ROS水平测定

将20 μmol·L^-1槲皮素、柚皮素、儿茶素、AIP和10 mmol·L^-1 N，N-二甲基硫脲（DMTU，一种ROS清除剂）分别添加到增殖培养基中，处理7 d时，测定愈伤组织ROS水平。每个处理设置3皿重复。

1.4.1　H2DCFDA荧光检测

利用10 μmol·L^-1 H2DCFDA荧光探针（MCE，上海）对上述处理的愈伤组织室温抚育5 min，用pH5.8的PBS溶液进行3次5 min的洗脱，在荧光显微镜（Carl Zeiss，Jena，德国）下观察愈伤组织样本荧光强度并照相。

1.4.2　DAB和NBT检测

通过硝基蓝四唑（NBT）和3，3′-二氨基联 苯胺（DAB）对愈伤组织的超氧阴离子（{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{·-}）和过 氧化氢（H₂O₂）积累进行组织化学染色。分别用 1 g·L^-1 DAB和2 g·L^-1 NBT浸没愈伤组织，在室 温下避光孵育5~10 min，置于体视显微镜下观 察。其中，DAB与内源性H₂O₂反应形成红棕色 沉淀；NBT与内源性{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{·-}反应形成深蓝色的甲臜 化合物。

1.5　抗氧化酶活性测定

将胚性愈伤组织置于添加20 μmol·L^-1槲皮素、柚皮素、儿茶素及AIP的增殖培养基培养7 d后，对胚性愈伤组织分装取材，按照每个生理指标取0.3 g新鲜愈伤组织（一个样品0.1 g，设置3次重复）进行收集。将收集的样品保存至2 mL冷冻管中，经液氮冷冻后置于冰箱中-80 ℃保存备用。采用氮蓝四唑光化学还原法测定SOD活性，愈创木酚显色法测定POD活性，H₂O₂分解法测定CAT活性，比色法测定H₂O₂含量，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，分光光度法测定植物类黄酮含量，A_SA比色法测定抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性，硝基苯酚法测定谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性。

1.6　数据处理

采用Excel 2019整理、统计试验数据，利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和邓肯多重比较（Duncan’s new multiple range test，α=0.05），利用GraphPad Prism 9软件制图。

2 结果与分析

2.1　外源黄酮及AIP处理对红松胚性愈伤组织增殖的影响

在增殖培养7 d和14 d时，胚性愈伤组织增殖率随着槲皮素、柚皮素、儿茶素处理浓度的升高呈降低趋势（图1），特别是在50 μmol·L^-1处理下开始表现出抑制增殖效果，在100 μmol·L^-1处理下抑制作用最强。在早期培养过程中，不同浓度AIP处理的愈伤组织增殖率略高于对照，但与对照相比无显著差异。

2.2　外源黄酮及AIP处理对体胚诱导数量的影响

外源黄酮处理影响红松体胚发生数量（P<0.05），体胚发生数量随着外源黄酮浓度的升高呈先升高后降低趋势。其中，20 μmol·L^-1浓度不同黄酮处理均显著提高体胚发生数量，体胚发生数量最高为儿茶素处理，平均达到117个·g^-1（图2C），其次为槲皮素处理（111个·g^-1）（图2A）和柚皮素处理（97个·g^-1）（图2B）。而不同浓度AIP处理后，除10 μmol·L^-1浓度处理外，其余AIP浓度处理的愈伤组织体胚发生数量显著低于对照（图2D）。

2.3　外源黄酮及AIP处理对红松愈伤组织氧化胁迫的影响

外源黄酮和DMTU处理的愈伤组织经H2DCFDA染色后有较弱的荧光信号（图3A~3L），表明其体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）维持在较低水平，而CK荧光信号较强，暗示愈伤组织中ROS含量较高。外源黄酮和DMTU处理的愈伤组织经DAB染色后颜色较浅；AIP处理和未经处理的愈伤组织颜色较深，表明体内H₂O₂水平较高（图3M~3R）。外源黄酮和DMTU处理的愈伤组织经NBT染色后颜色较浅；AIP处理和未经处理的愈伤组织呈深蓝色，表明体内{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{·-}含量较高（图3S~3X）。

进一步对愈伤组织中的H₂O₂和MDA含量进行测定发现，外源黄酮处理影响愈伤组织中H₂O₂和MDA含量。20 μmol·L^-1槲皮素、柚皮素、儿茶素处理组的愈伤组织中H₂O₂含量低于对照组，其中儿茶素处理后的愈伤组织中H₂O₂含量显著降低，而AIP处理后的愈伤组织中H₂O₂含量显著高于对照组（图4A）。外源黄酮处理后，愈伤组织中MDA含量显著降低，而AIP处理后愈伤组织中MDA含量与对照组相比无显著差异（图4B）。

2.4　外源黄酮及AIP处理对红松愈伤组织抗氧化酶的影响

柚皮素和儿茶素处理显著促进愈伤组织中 黄酮积累（图5A）。柚皮素和儿茶素处理显著提 高愈伤组织中SOD活性，降低CAT和POD活 性（图5B~5D）。而GPX和APX活性在柚皮素处理下略有降低，与对照相比没有达到显著水平（图5E~5F）。与之相比，AIP处理降低了愈伤组织中黄酮含量，但对抗氧化酶活性与对照相比无显著影响。

3 讨论

3.1　黄酮参与红松体胚发生过程

红松体胚发生过程主要由间接体胚发生途径实现，主要包括胚性愈伤组织的诱导、增殖、分化和植株再生4个阶段。研究发现，黄酮在体胚发生过程中扮演重要角色。如在植株再生能力较高的超胚性苜蓿（Medicago sativa）细胞系中，黄酮的生物合成途径得到了上调表达^［18］。在棉花（Clossypium hirsutum）体胚中，黄酮在愈伤组织分化和体细胞胚胎发育阶段均发生大量积累^［19］；同时，抑制类黄酮合成基因表达可阻断愈伤组织的发生，而外源添加多种黄酮（如二氢槲皮素、二氢山奈酚、山奈酚或槲皮素）可促进愈伤组织形成和与细胞周期相关的基因表达^［20］。本研究发现，红松愈伤组织增殖效率在施加外源黄酮浓度为20 μmol·L^-1以上时受到显著抑制（图1）。在植物中，黄酮的合成途径是苯丙烷代谢途径的分支，其中PAL是苯丙烷代谢途径关键的限速酶，位于黄酮和木质素生物合成途径的上游。AIP是一种能够竞争性抑制PAL活性的化合物，在培养基中添加AIP能有效降低愈伤组织多酚含量，降低愈伤组织褐化程度^［21］。Bamneshin等^［22］发现在悬浮培养过程中添加AIP能够有效缓解光照对细胞增殖的抑制作用。本研究用AIP处理愈伤组织后发现，不同浓度AIP处理仅在增殖早期促进愈伤组织增殖，但随着培养时间的增加，其对红松愈伤组织增殖的影响并不显著。

本研究发现添加外源黄酮能够显著促进愈伤组织的体胚发生，其中，体胚发生数量在20 μmol·L^-1黄酮处理下达到最高。这说明黄酮对红松体胚发生的影响存在最适浓度，而高于20 μmol·L^-1黄酮处理会对红松愈伤组织的增殖和体胚转化能力产生抑制作用（图2）。在水曲柳（Fraxinus mandshurica）体胚发生研究中也得到了类似的结果，低浓度和高浓度的抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）会抑制水曲柳外植体的褐化和体胚发生，适宜浓度的AsA会促进水曲柳合子胚体胚发生^［23］。本研究发现：在培养基中添加AIP抑制了红松体胚形成，说明抑制苯丙烷途径会降低体胚发生效率。

3.2　黄酮通过调节氧化胁迫平衡影响体胚发生

植物体正常的生命活动与代谢会产生活性氧（ROS），ROS包括羟基自由基（OH^-）、单态氧（¹O₂）、{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{·-}和H₂O₂等多种类型，适当的ROS水平在愈伤组织增殖及分化过程中发挥重要作用，而ROS含量过多时对植物细胞产生毒害，并且会使细胞受到氧化胁迫而形成MDA。MDA是膜脂过氧化的重要指标，其含量表示细胞内的氧化性损伤对膜系统的伤害程度。为了保护细胞免受ROS损伤，植物能够利用酶促和非酶促系统来去除这些物质，从而使氧化性损伤与抗氧化防御处于动态平衡^［24］。黄酮作为一种天然抗氧化剂，其抗氧化自由基的作用机制与酚类物质相似，都是与活性氧自由基结合起到抗氧化作用。有研究^［25］发现黄酮的抗氧化活性可能有助于愈伤组织的诱导和体胚发生。本研究中，添加外源黄酮降低了红松胚性愈伤组织中H₂O₂和MDA含量（图4），这说明黄酮作为强的抗氧化剂清除了愈伤组织中的活性氧，降低了活性氧对细胞的氧化性损伤，保护细胞膜的完整性。

在植物体内，酶促抗氧化系统包括SOD、POD、CAT、APX和GPX等，其主要通过清除活性氧自由基，从而降低体内的活性氧含量。夏凯丽等^［26］研究发现，黑莓（Rubus fruticosus）不同类型的胚性愈伤组织中，具有较高活性SOD及较低活性POD、MDA的松散型愈伤组织最适宜进行早期体胚诱导。任宁等^［27］对百子莲（Agapanthus africanus）胚性愈伤组织外源施加毒莠定（picloram，PIC）后发现，在1.5 mg·L^-1处理下愈伤组织成胚能力最强；进一步对抗氧化酶活性进行相关性分析发现，愈伤组织表现成胚能力与SOD活性呈显著正相关，与POD和CAT活性呈显著负相关。与上述研究结果相似，本研究发现：黄酮处理能够提高红松胚性愈伤组织中SOD活性，降低POD和CAT活性。除SOD、CAT和POD之外，APX和GPX也是重要的酶促抗氧化系统成员^［28］；其中，APX不仅能直接作用于H₂O₂，还能以AsA为底物通过调控AsA-GSH循环的代谢水平，清除掉细胞中多余的H₂O₂^［29］。周小华等^［30］研究铝胁迫下水稻（Oryza sativa）添加外源AsA后发现，外源AsA能增强水稻根尖的内源AsA、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及APX活性，降低MDA和H₂O₂含量，缓解铝胁迫下水稻脂膜氧化程度。Gao等^［31］发现，外源添加GSH能促进红松愈伤组织中早期体胚的形成，同时提高SOD和CAT活性，降低细胞内H₂O₂和MDA含量。而本研究发现：黄酮处理降低了愈伤组织中GPX和APX的活性，可能是由于愈伤组织中黄酮含量的升高使活性氧水平降低，从而导致了这些抗氧化酶活性下降。

4 结论

在20 μmol·L^-1外源黄酮类化学物（槲皮素、柚皮素和儿茶素）处理下，红松胚性愈伤组织的体胚发生数量达到最高，20 μmol·L^-1及以上浓度外源黄酮类化学物处理抑制胚性愈伤组织增殖；外源黄酮处理降低了胚性愈伤组织中ROS水平及MDA水平，可减弱ROS对胚性愈伤组织的毒害作用。本研究结果可为红松胚性愈伤组织胚性的保持及利用人为干预优化体胚发生技术体系提供重要参考。

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