艾花不同物候期挥发性成分特征及花粉形态和发育过程

Characteristics of Volatile Components in Different Phenological Stages and Pollen Morphology and Developmental Process of Artemisia argyi

摘要

在艾（Artemisia argyi）花不同发育期进行形态学观察并利用GC-MS测定其挥发性成分含量，利用光学显微镜和扫描电镜观察花粉结构并利用透射电镜观察花粉的发育过程。结果发现：艾为椭圆形头状花序，盛开艾花花冠呈紫色或黄色。艾花中桉油精、左旋樟脑、龙脑等大部分药用挥发性成分相对含量随艾花开放逐渐降低，而侧柏酮相对含量呈逐渐上升的趋势。艾花粉为3萌发孔和3孔沟结构，表面有刺状-颗粒状复合纹饰，刺为钝形刺，刺间有颗粒状凸起，形状为圆球形和长球形，存在花粉二型现象。观察花粉母细胞时期、单核小孢子时期、双核花粉时期、花粉成熟期的花粉特征及花粉囊中环境变化过程，发现花药中存在大量异常花粉粒。该研究对艾花及花粉特征进行了系统研究，可为艾的形态学、孢粉学和繁殖学研究提供参考。

Abstract

The morphology of Artemisia argyi flowers at various developmental stages was observed， and the contents of volatile components were determined using GC-MS. The pollen structure was examined using optical and scanning electron microscopes， and the pollen development process was observed under a transmission electron microscope， respectively. The results showed that A. argyi had oval head inflorescence with purple or yellow corolla at blooming， the relative content of most medicinal volatile components such as eucalyptol， camphor and borneol decreased with blooming， while the content of thujone gradually increased. The pollen of A. argyi had the structure of three germination pores and three channels， and the surface was adorned with a thorny， granular compound ornament， and the thorns were blunt and interspersed with granular protrusions， spherical and oblong in shape， exhibiting pollen dimorphism. By observing the characteristics of pollen mother cell stage， mononuclear microspore stage， binucleate pollen stage， pollen maturation stage and the environmental change process in the pollen sac， it was found that there were a large number of abnormal pollen grainsin the A. argyi anthers. The characteristics of A. argyi flowers and pollens were systematically investigated， which would provide a reference for morphological， palynological， and reproductive research on A. argyi.

Graphical abstract

关键词

艾花 / 挥发性成分 / 孢粉 / 花部特征 / 花部发育

Key words

Artemisia argyi flower / volatile components / sporopollen / floral traits / floral development

艾（Artemisia argyi）为菊科（Asteraceae）蒿属（Artemisia）多年生草本植物，植株有浓烈香气，是一种应用历史悠久的大宗中药材。艾全草入药，具有温经止血、祛湿散寒等功效^［1］，作灸用可治疗关节炎^［2］、肿瘤^［3］、结肠炎^［4］等疾病，作食用可用于制作艾青团、艾糕、艾酒等，民间还有熏艾烟、洗艾澡、悬艾人、戴艾虎、睡艾枕等民俗。现今，艾已被广泛应用于医疗、养生保健、畜牧养殖、日化等领域，具有重要的经济与药用价值。艾生命力顽强，分布广泛，常见于低海拔至中海拔地区的荒地、路旁、河边及山坡等地，也见于森林及草原地区。随着艾需求量的增加，包括河南、河北、湖北、湖南、四川、安徽、陕西、甘肃在内的多个省开始大面积人工驯化栽培。截至2020年，国内艾产业总产值达395.13亿元，具有广阔的发展前景。然而，艾在人工栽培过程中也存在一些问题。艾的种子繁殖出苗率极低（约为5%）^［5］，生产上主要采用以根状茎为繁殖材料的无性繁殖方式^［6］，这也导致了品种退化、优良性状丢失等问题。因此，通过有性繁殖方式培育优质高产的艾品种意义重大，而对于繁殖器官“花”的研究是人工杂交培育研究的基础^［7］。

花的形态学鉴定可为物种进化、分类和鉴定提供可靠依据^［8］，目前已有部分对蒿属物种花及花粉的研究。蒋林和林有润^［9］观察了58种蒿属植物的花粉结构，根据花粉外壁纹饰，将蒿属花粉分为2大类和4个亚型；孙京田和徐砚田^［10］对山东产 10种蒿属植物的花粉分别做了光学显微镜和扫描电镜观察，通过观察花粉的外部形态、萌发器官、表面纹饰及花粉大小为现代植物分类方法中种级水平分类研究提供参考；山宝琴等^［11］观察了黄土高原32种蒿属植物的花粉形态，为蒿属系统分类研究提供了孢粉学资料。除此之外，也有一些针对黄花蒿（Artemisia annua）^［12-13］、冷蒿（Artemisia frigida）^［14-15］、乌丹蒿（Artemisia wudanica）^［16-18］、马先蒿（Pedicularis sylvatica）^［19］等的孢粉学专项研究。目前，对艾的研究多集中于药理作用、化学成分、品质评价等方面^［20-24］，研究对象多为艾的药用部位叶片，仅有《中国植物志》对艾花表型进行了介绍，蒋林和林有润^［9］描述了艾的圆球形花粉特征并拍摄了扫描电镜下的花粉粒形态，而艾花挥发性成分的相关研究鲜见报道。因此，本研究观察不同物候期艾花的形态特征并测定挥发性成分含量，同时观察艾花粉粒的显微特征及艾小孢子发生和花粉发育规律，以期为艾的表型研究、物种鉴定、遗传育种提供依据。

1 材料和方法

1.1　植物材料

艾资源于2018年3月采自湖北省蕲春县八里湖乡（30.25°N，115.46°E），为当地的常用品种“蕲春1号”，经湖北中医药大学教授刘大会鉴定后，保存于湖北中医药大学药用植物资源圃中（30.45°N，114.26°E）。

1.2　艾花物候期确定及样品制备

艾种质资源丰富多样，不同品种开花时期各有不同，部分艾现蕾较早（7月初至7月中旬），经过约20 d发育开始开花，至9—10月艾开花结束。每次观察选取10株生长状况良好的成年植株作为标准株，参考刘辉等^［16］、韩晓亮^［25］观察蒿属植物开花状况得出的艾开花物候期，将植株主茎或分枝上出现肉眼能辨认的第1个花蕾时期称为现蕾期（H1），全株5%的花序开放称为始花期（H2），全株50%的花序开放称为盛花期（H3），全株95%的花序开放称为衰退期（H4），全株50%的花序开花结束为落花期（H5），全株95%的花序变黑为末花期（H6）。本研究观察并记录了艾在6个不同开花物候的形态特征（图1）。自2023年7月艾现蕾开始，观察不同发育时期的花序，并取艾花置于冰箱中-80 ℃保存备用。另取花序于2.5%戊二醛溶液（0.1 mmol·L^-1，pH=7.0的硫酸缓冲液）中进行前固定，于冰箱中4 ℃保存。

1.3　艾花挥发性成分含量测定

称取艾花鲜样0.1 g置于20 mL干燥的顶空进样瓶中，用瓶盖密封，使用手动进样器（含萃取头）在80 ℃条件下顶空萃取40 min，立即放入ThermoFisher Trace 1310型气相质谱联用仪（美国ThermoFisher公司）进样口中解吸附3 min（色谱和质谱条件参考课题组前期研究^［26］），检测挥发性成分含量，每组样品进行3次生物学重复。

1.4　显微观察

1.4.1　光学显微镜观察

取充分成熟将要开花的花蕾，剥除花被片后取出花药，置于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎释放花粉粒，加入1~2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，于UCMOS03100KPA型光学显微镜（杭州ToupCam公司）下观察。

1.4.2　扫描电镜观察

将充分干燥的花药固定于导电胶带上，用解剖针将花药戳破并均匀涂抹开，之后利用离子溅射仪在真空状态下进行喷金镀膜，将样品置于样品台上，利用JSM-6510LV型扫描电镜（日本电子JEOL）在30 kV加速电压下观察花粉结构，并利用拍摄软件采集视野内图像。

1.4.3　透射电镜观察

利用0.1 mol·L^-1的磷酸盐缓冲液重复洗涤固定液中的花序样品，经1%四氧化锇进行后固定，置于冰箱中4 ℃下12 h。使用50%、70%、90%的乙醇溶液进行样品脱水处理，按1∶1的体积比加入90%乙醇和90%丙酮脱水，利用90%丙酮脱水，最后利用100%丙酮脱水2次，以上每次脱水时间均为15~20 min。样品经渗透、包埋、固化、切片后，使用H-7650透射电子显微镜（日本Hitachi日立公司）在80 kV电压下扫描，利用832 Charge-Coupled Device相机（Gatan）采集图像。

1.5　数据处理

运用Mainlib和replib谱库对GC-MS分析得到的挥发油总离子流图进行谱库检索；采用Excel 2010对数据进行整理；采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004年版）绘制指纹图谱叠加图并计算相似度。

2 结果与分析

2.1　艾开花物候期观察结果

艾现蕾前，茎尖或分支顶端变态叶变为淡黄色，逐步形成苞片，产生花蕾。艾为椭圆形头状花序，直径0.2~0.4 cm，无梗或近无梗，数枚或10余枚花在分枝上排成小型的穗状或复穗状花序。随着艾花的逐渐开放，花蕾膨大，细长的花丝伸出花冠外，花冠由黄色变为紫色（图1），部分艾品种在艾花完全开放后仍呈黄色（图2）。艾花药为狭线形，先端附属物为长三角形，花柱与花冠近等长或略长于花冠，叉端截形，并有睫毛。

2.2　艾花不同物候期的挥发性成分特征

以湖北省蕲春县常见的蕲艾品种“蕲春一号”为研究对象，利用固相微萃取技术对花蕾出现后始花期至末花期艾花中的挥发性成分含量进行测定，并绘制指纹图谱叠加谱（图3）。结果发现，5个不同时期艾花中共检测出46种挥发性成分，包括α-蒎烯、（+）-柠檬烯、桉油精、侧柏酮、龙脑等单萜类成分，β-石竹烯等倍半萜类成分，植酮等二萜类成分，螺内酯、乙酸松油酯、亚油酸癸酯、棕榈酸己酯、蓍草薁内酯、二十二酸甲酯等酯类成分，胡椒酮、紫苏醛等醛酮类成分，化学成分类型丰富。采用峰面积归一化法计算各成分峰面积占总流出峰面积的相对百分含量及各成分在5个不同时期的平均相对含量，发现α-侧柏酮、二十五烷、十氢二甲基甲乙烯基萘酚、β-石竹烯、正二十七烷、棕榈酸、亚油酸癸酯、桉油精、左旋樟脑9种成分平均相对含量较高，这些成分占总挥发性成分的55.27%。艾花中存在丰富的药用成分，其中桉油精、左旋樟脑、4-萜烯醇、龙脑和β-石竹烯是艾花中含量较高且药用活性明显的成分；随着艾花的发育，这5种成分含量均呈持续降低的趋势。侧柏酮具有抗肿瘤、抗癌细胞转移、抗糖尿病等功效，艾花中侧柏酮含量随着艾花的发育呈逐渐升高的趋势，到落花期已达35.83%。变异系数是反映性状指标遗传多样性的重要参数，本研究计算了各成分在不同物候期相对含量的变异系数均值，结果显示：46种成分的变异系数范围为11.00%~190.89%，其中乙酸松油酯（190.89%）、棕榈酸（110.11%）、g-榄香烯（110.75%）、棕榈酸己酯（106.70%）、二十二酸甲酯（101.46%）和顺-香芹醇（101.36%）是变异系数最大的成分。变异系数结果显示，随着开花物候的变化，艾花中的挥发性成分存在丰富的变异（表1）。

2.3　艾花粉粒形态特征分析

通过光学显微镜观察艾花丝、花药和花粉粒形态，结果如图4所示。花粉极面观均为圆形，中间包含1个触及到圆弧的三角形，可以看出艾花粉为3孔沟，外壁在近沟处逐渐变薄，呈现出颗粒-网状纹理；花粉粒赤道面观呈现椭圆形和圆形2种状态，显示出花粉粒形态的二型性，其中长球形花粉粒的赤道面观为两头尖中间略宽的船形，沟长达两极。在扫描电镜下观察艾的花粉粒，如图5所示。可见成熟花粉粒均为单粒花粉粒，具3孔沟。花粉粒表面为刺状-颗粒状复合纹饰，刺为圆锥形短刺，顶端钝圆，可称为钝形刺，刺间有多数颗粒状凸起。花粉主要分为长圆球形和圆球形2种：长圆球形花粉极少见，极面观为三裂圆形，赤道面观为长椭圆形，两端稍尖，沟深而细长，沟膜光滑，沟缘清晰，极轴为26~30 μm，赤道轴为23~26 μm；圆球形花粉较为常见，极面观为三裂圆形，面积相对较大，赤道面观为三裂片圆形，沟为由外向内逐渐深入的圆锥状凹陷，沟较短，内孔外突明显，具不规则孔膜，花粉粒极轴与赤道轴基本等长，为19~22 μm，整体略小于长球形花粉。

2.4　不同发育阶段艾花粉粒超微结构观察结果

2.4.1　花粉母细胞时期

利用透射电镜观察花药横切面发现，在花粉母细胞时期，四裂花药逐步形成左右对称的4个药室，花粉囊内产生花粉粒（图6A）。药室壁由4层细胞构成，从外到内依次为表皮（E）、药室内壁（En）、中层（ML）和绒毡层（T），排列紧密，层次清晰。糖蛋白、淀粉和油脂等营养物质通过药室内壁被逐步输送到绒毡层中，供应花粉粒发育所需的养分（图6B）。小孢子母细胞（MMC）来源于初生造孢细胞，细胞核大而明显，细胞质浓厚，没有明显液泡，进入减数分裂阶段后，孢子体形成二分体或四分体（Tds），直至形成单核小孢子（图6C）。

2.4.2　单核小孢子时期

单核小孢子早期，细胞核位于细胞中心且清晰可见，内容物饱满、细胞质浓厚，无液泡，内壁、外 壁较薄，整体呈圆球形，称为单核居中期（图6D）。随着小孢子的发育，细胞壁逐渐收缩，体型变为不规则的三角状，3个向内凹陷的萌发孔出现，花粉内壁厚度基本不变，外壁近萌发孔处渐薄，花粉粒内部出现小液泡，并逐步融合为中央大液泡，将细胞核排挤到细胞边缘，此时细胞质中细胞器较少，主要为线粒体和核糖体，称为单核靠边期（图6E）。

2.4.3　双核花粉时期

随着花药的发育，同侧的2个花粉囊之间的分割被逐渐打破，绒毡层也逐渐消失（图6F），营养物质被消耗殆尽，小孢子核经有丝分裂形成营养细胞核和生殖细胞核，进入双核期（图6G）。细胞再次进行分裂，形成较小的生殖细胞和体积较大的营养细胞。生殖细胞未见明显质体，由紧贴细胞壁逐渐向营养细胞靠进，最后悬浮于营养细胞的细胞质中（图6H），花粉内壁开始发育，细胞质中开始积累淀粉粒和糖蛋白，随着淀粉粒的增多，液泡逐渐缩小消失，花粉内壁基本发育完成，外壁和内壁交界处有一层致密的细胞将外壁和内壁隔开（图6I）。

2.4.4　花粉成熟期

成熟时期的花粉壁已经发育完全，花粉呈圆形或椭圆形，花粉内富集后含物，花药裂开后，花粉粒从花药中散出，待传粉后在生殖细胞内分裂形成雄配子体。同时，在花药中发现大量异常花粉粒，这类花粉粒体积较小，细胞壁较厚，细胞质中未见淀粉类物质，随着细胞质开始降解、凝缩并向外壁一侧聚集，内侧出现空隙，细胞核开始凋亡，最后只剩下空心花粉壁和深色残迹，处于空泡化状态，成为不育花粉（图6J~6L）。

3 讨论

3.1　艾开花物候及花部特征

本研究选定了6个艾开花物候期，分别为现蕾期、始花期、盛花期、衰退期、落花期和末花期，并明确了不同物候期艾花的特征。艾为椭圆形头状花序，开花顺序为从茎顶部或分枝顶部依次向底部开放，这与乌丹蒿^［15］、冷蒿^［27］等自上而下的开花顺序一致，区别于黄花蒿自下而上的开花顺序^［28］。花冠颜色对于物种鉴定有重要意义，《中国植物志》中记载艾花花冠为紫色，然而在本研究中观察到了花冠为黄色品种，可用于艾的品种内鉴定。本研究以蕲春一号为代表，测定了不同物候期艾花中挥发性成分含量，发现艾花中桉油精、左旋樟脑、4-萜烯醇、龙脑和β-石竹烯等药用活性明显的成分相对含量随艾花开放呈逐渐降低的趋势，到末花期时含量已极低，说明艾花的药用价值随艾花开放逐渐降低，艾叶采收应在艾开花前进行，对于部分开花较早的品种，应提前采收。

3.2　艾花粉粒的二型性

花粉粒是种子繁殖中产生雄配子体的核心部位，具有保守性、稳定性、不易变性，花粉形态研究是孢粉分析的基础，对于探究植物起源、分化和品种鉴定具有重要意义^［29］。本研究观察到艾的花粉形态与蒿属植物花粉形态总体特征一致，为小型花粉，具有3萌发孔和3孔沟，花粉表面为刺状-颗粒状复合纹饰。通过赤道面观可看出艾花粉存在二型性，即2种不同形态的花粉粒存在于同一花药中。扫描电镜观察视野内大多数花粉粒为圆球形花粉粒，为文献^［9］中所记载的艾花粉形态，另一种较少见的花粉粒为长球形花粉粒。据文献报道，冷蒿^［15］、乌丹蒿^［18］、黑沙蒿（Artemisia ordosica）^［30］等蒿属植物中均存在花粉二型现象。花粉二型性产生的原因与植物自身的遗传结构有关，如花粉母细胞的减数分裂轴向改变、有丝分裂时纺锤体平周分裂、雄蕊花丝长短差异等均可能导致花粉粒表现出二型性^［18］。除此之外，植物所处的生存环境也可能对花粉形态产生影响，如黑沙蒿为适应干旱少雨的荒漠气候，其花粉表面纹饰退化为小刺状而表现出二型性^［30］。本研究中圆球形花粉比例远高于长球形花粉，不同形态的花粉粒与柱头的亲和性可能有所差异^［31］，具体有待于进一步研究。

3.3　艾小孢子的发生和雄配子体的形成

本文利用透射电镜观察了不同发育阶段艾花粉粒的超微结构，描述了花粉母细胞时期、单核小孢子时期、双核花粉时期、花粉成熟期的花粉特征及花粉囊中环境变化过程。研究发现，艾花药中存在大量异常花粉粒，这些花粉粒由于细胞核的凋亡并无活力，直接导致部分花粉粒的败育。雄性不育发生的时期具有不确定性，Laser和Lersten^［32］研究提出，双子叶植物多于造孢时期至四分体形成时期出现雄性不育现象。本研究在花粉成熟期发现了大量不育花粉，但在花粉粒发育的其他阶段，也能在花粉囊中发现少数异常的花粉粒，这些不育花粉均只有1个细胞核，细胞质和细胞核显示出逐渐脱离母细胞的倾向，这可能是由于小孢子在减数分裂时营养物质不足而发生异常，从而导致花粉败育^［6］。

4 结论

本研究依照艾开花过程中表型特征将其分为6个时期，明确了不同开花物候期艾花中挥发性成分的变化规律，发现随艾花开放桉油精、左旋樟脑、龙脑等药用成分含量呈逐渐降低的趋势，侧柏酮含量呈逐渐增加的趋势。对艾花粉粒的形态进行显微观察，发现艾花粉呈现二型性，圆球形和长球形花粉粒共存于同一花药中，扩充了艾孢粉学研究资料。利用透射电镜观察了艾小孢子的发生和雄配子体的形成过程，发现花粉囊中存在大量败育花粉粒，为艾的种子繁殖研究提供了参考。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2023YFC3503804)

国家自然科学基金项目(32270391)

湖北省自然科学基金创新群体项目(2023AFA032)