基于EMP和TCA循环途径研究硅对干旱胁迫下党参多糖合成的调控

Silicon-mediated Regulation on Polysaccharides Synthesis of Codonopsis pilosula under Drought Stress Based on EMP and TCA cycle Pathways

摘要

近年来，极端气候频发、雨水分布不均，造成党参（Codonopsis pilosula）关键生育期缺水，导致质量和产量下降。针对这一问题，该研究以党参为对象，从糖酵解（EMP）及三羧酸循环（TCA）角度探究硅对干旱胁迫下党参多糖合成的调控效应。设置正常水分（CK）、15% PEG-6000干旱（D）及施加硅后再15% PEG-6000干旱 （Si+D）3个处理组，Si+D组在干旱处理前第7天每盆施用200 mL 2 mmol⋅L^-1硅酸钾溶液，干旱处理至7、14、21 d时取样，测定EMP及TCA相关代谢物含量、酶活性和基因相对表达量，同时测定党参多糖及其生物合成相关物质含量，综合分析硅对干旱胁迫下党参多糖合成的调控。结果表明：（1）干旱胁迫导致党参光合色素含量降低，加速蔗糖、果糖及葡萄糖等物质消耗，促进EMP和TCA途径中的能量消耗用于淀粉、多糖等物质的合成及积累，存在产量和质量消长的现象。（2）硅的施用提高了党参叶片相对含水量、光合色素含量、蔗糖及果糖含量，降低了淀粉合成相关酶活性、增强了淀粉分解相关酶活性，导致淀粉、多糖含量下降，但党参整体产量提高；硅促进干旱胁迫下党参EMP途径，阻止TCA过程，使得EMP终产物丙酮酸合成柠檬酸并积累。硅的施加通过影响党参光合作用、调控EMP及TCA途径能量生成及分配，增强党参抵御干旱的能力，整体上对党参多糖的合成及质量、产量起到了正向的调控作用。但随着干旱胁迫时间的延长，调控效应有逐渐减弱的趋势。

Abstract

In recent years， frequent extreme weather and uneven distribution of rain have caused water shortage in the key growth period of Codonopsis pilosula， leading to declines in quality and yield. To solve this problem， this study used Codonopsis pilosula as the object， investigated the regulatory effects of C. pilosula polysaccharides（CPPs） synthesis under drought stress by siliconaddition based on glycolysis （EMP） and tricarboxylic acid cycle（TCA）. Three groups were set up： water（CK）， drought by 15% PEG-6000（D） and drought by 15% PEG-6000 after silicon treatment（Si+D）. In Si+D group， 200 mL of 2 mmol⋅L^-1 potassium silicate solution was applied to each basin on the 7th day before drought treatment. EMP and TCA-related substances， enzymes activity and key genes expression were measured at 7， 14 and 21 days respectively after drought treatment. Meanwhile， the contents of CPPs and its biosynthesis-related substances were measured to analyze comprehensively the regulation of CPPs synthesis by silicon under drought stress. The results showed that： （1） Drought stress weakened the content of photosynthetic pigment of C. pilosula， accelerated the consumption of sucrose， fructose and glucose， and enhanced the energy consumption in EMP and TCA pathways for the synthesis and accumulation of starch and polysaccharide， and there was a mutual fluctuation of yield and quality. （2） The silicon addition enhanced the content of relative leaf water of C. pilosula， inhibited the content of photosynthetic pigments， increased the sucrose and fructose contents， decreased the enzymes activity related to starch synthesis and increased the enzymes activity related to starch decomposition， resulting in the decrease of starch and polysaccharide contents， but the overall yield of C. pilosula were increased. Silicon addition promoted the EMP pathway of C. pilosula under drought stress， prevented the TCA cycle process， and made pyruvic acid， the end product of EMP， synthesize into citric acid and its accumulation. The application of silicon might affect the photosynthesis of C. pilosula， regulate the energy generation and distribution of EMP and TCA pathways， enhance the ability of C. pilosula to resist drought， and play a positive role in the synthesis of polysaccharide and the quality and yield of C. pilosula. However， with the extension of drought stress time， the regulation effect was weakened gradually.

Graphical abstract

关键词

党参 / 干旱胁迫 / 硅 / 糖酵解 / 三羧酸循环 / 党参多糖

Key words

Codonopsis pilosula / drought stress / silicon / glycolysis / tricarboxylic acid cycle / Codonopsis pilosula polysaccharides

党参（Codonopsis pilosula）为我国传统大宗中药材。党参多糖是党参重要的药效物质之一，因其药理作用及在食品、保健品等领域的广泛使用，市场需求量及质量要求逐年提高，保障党参优质高产已经成为党参生产中的关键问题。逆境胁迫是限制作物生长发育的主要非生物因素^［1］，对大多药用植物而言，适度逆境胁迫更有利于次生代谢产物的合成和积累，即意味着药材品质的提高^［2-3］，但严重胁迫明显抑制作物生长，反而导致生物量和药材活性成分积累量下降^［4-6］。

植物合成次生代谢产物主要通过初生代谢中的光合作用、糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）等途径提供所需能量和一些小分子化合物原料。EMP及TCA作为植物最基本的生理过程，其代谢产物是参与植物形态建成和生命代谢的重要物质，且其代谢强度、协调程度及其在植物生长发育过程中的动态变化能直接或间接影响植物次生代谢产物的含量和组成比例^［7-9］，进而直接影响药用植物品质。近年来，大量研究表明，干旱胁迫能使植物光合速率降低，改变己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK）等代谢相关酶活性，抑制EMP及TCA途径，降低ATP生成，植物生长代谢所需能量供给减少，进而抑制植物生长^［10-11］。由此可见，干旱胁迫明显影响植物EMP及TCA产物及相关酶活性，打破代谢平衡，影响植物次生代谢产物合成，进而影响中药材的产量及质量。

硅是植物生长发育所需的有益元素，更是一种对环境友好的元素。在土壤中，植物主要吸收单硅酸形式的硅。硅在被植物吸收后主要以“植硅体”的形式在植物体中形成无定形的二氧化硅颗粒屏障，主要存在于细胞间隙、细胞腔及细胞壁中^［12］。硅有增强植物节位、叶片木质部和韧皮部完整性，减少维管束异常等作用，提高植物抵御各种生物胁迫的能力^［13-14］。目前，有关外源硅调控植物抗旱性的研究大多集中在抗氧化系统、离子运输、水分代谢等方面^［15］。近年来，也有关于硅调控植物EMP及TCA方面的研究，例如硅的施加提高了苜蓿（Medicago sativa）种子萌发过程中可溶性糖含量^［16］，降低了因干旱胁迫升高的己糖/蔗糖^［17］。综上所述，硅可以通过调控植物中EMP及TCA代谢来提高其抗逆胁迫能力，促进植物生长发育，调控次生代谢产物合成。

本研究采用聚乙二醇（PEG）模拟干旱，研究干旱胁迫下党参中EMP及TCA相关酶活性、关键基因表达和党参多糖及其生物合成起始物质、中间产物对硅的响应特征，揭示干旱胁迫下硅在EMP及TCA循环中对党参多糖合成的调控作用，为实现干旱地区党参节水优质栽培及阐明硅在植物耐旱适应中的作用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1　试验设计

本研究试验地点位于甘肃省和政县松鸣岩镇的甘肃中医药大学和政药用植物园（35°15′45″N，103°24′32″E），海拔2 430 m，所用党参种苗来自甘肃省陇南市宕昌县。经甘肃中医药大学王惠珍教授鉴定为党参，所用营养塑料盆规格为上口直径25 cm，高30 cm。以PEG-6000模拟干旱，设置3个处理：正常水分管理（CK）、15% PEG-6000干旱处理（D）、施加硅后再干旱处理（Si+D）。每个处理设置9盆重复，每盆4株党参种苗，待生长至开花期时开始处理。Si+D组每盆先施用2 mmol·L^-1硅酸钾溶液200 mL，于7 d后与其他组统一进行干旱胁迫处理^［18-19］。干旱胁迫首次处理以盆底有溶液渗出为准，以保证土壤中PEG-6000浓度恒定。之后每隔1 d CK浇灌水200 mL，干旱处理浇灌15% PEG-6000溶液200 mL，用于补充渗漏和蒸发，除处理浓度不同外其他管理措施均一致^［20］。在处理至7、14、21 d时取样，每个处理每次取3盆，将每盆中4株党参的根、叶分开，用蒸馏水清洗干净，吸干表面水分，部分样品带回实验室测定生长指标及光合色素含量，其余样品装入速冻管放入液氮中带回实验室，再转入冰箱-80 ℃储藏，用于转录组高通量测序，以及物质含量及酶活性等测定。

1.2　生长指标及叶绿素含量测定

根长、根粗及根干鲜质量比参考陈彦宏^［21］的方法测定。

叶绿素含量及叶片相对含水量参考栗锦鹏^［22］的方法测定，叶片相对含水量计算公式为

相对含水量=（鲜质量-干质量）/（饱和水鲜质量-干质量）×100%（1）

1.3　多糖合成相关代谢物含量测定

党参蔗糖、果糖、葡萄糖含量参考陈彦宏^［21］的方法测定，多糖含量参考孙晓琛^［23］的方法测定。丙酮酸、淀粉含量均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定，柠檬酸含量采用上海钦诚生物科技有限公司提供的试剂盒测定。

党参多糖总量=平均多糖含量×平均根干质量（2）

式中：多糖总量用mg·根^-1表示。

1.4　EMP与TCA循环及多糖合成相关酶活性测定

己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）、苹果酸脱氢酶（MDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、α-淀粉酶（α-AL）、β-淀粉酶（β-AL）活性均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定；蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖转化酶（INV）、蔗糖合成酶（SS）、酸性转化酶（AI）、中性转化酶（NI）、异柠檬酸脱氢酶（ICD）、丙酮酸脱氢酶（PDH）、结合态淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、植物腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）活性均采用上海钦诚生物科技有限公司提供的试剂盒测定。酶活性单位“U”表示“酶在 特定条件下，1 min内转化1 μmol底物，或底物中1 μmol有关基团所需的酶量”。

1.5　转录组测序

取不同处理下培养14 d的党参叶片和根，每组样品3个重复，与华智生物技术有限公司合作进行转录组测序，设置LC （叶CK）vs LD（叶干旱）、LD vs LDS（叶硅加干旱）、RC（根CK） vs RD（根干旱）、RD vs RDS（根硅加干旱）共4个组，以q-value≤0.05且差异倍数|log₂（FoldChange）|≥1筛选差异表达基因。

1.6　数据处理

文中所涉及数据均为3次重复的平均值，采用SPSS 25.0软件进行数据统计及显著性分析，采用Origin Pro 2024、Graphpad Prism 9.5软件做图。

2 结果与分析

2.1　硅对干旱胁迫下党参生长特性的影响

干旱胁迫抑制党参生长，且胁迫至21 d时，抑制效果显著（图1）。硅处理（Si+D）对干旱引起的党参生长抑制有缓解作用；至21 d时，与干旱胁迫相比，硅处理的植株根粗和叶片相对含水量分别提高24.6%和24.7%（P<0.01），根干鲜质量比降低9.37%（P<0.05）。

2.2　硅对干旱胁迫下党参光合色素的影响

干旱胁迫下，党参叶片有明显稀疏及黄化的现象（图2）。施加硅受胁迫植株的叶片稀疏及黄化现象明显减轻，说明施加硅提高了党参耐旱性。

干旱胁迫导致党参叶绿素含量降低，而类胡萝卜素含量升高（图3）。施加硅可显著改善干旱对党参光合色素的影响，干旱胁迫至21 d时，硅处理植株叶绿素a和总叶绿素含量分别比干旱处理的植株提高56.9%和48.4%（P<0.01）。

2.3　硅对干旱胁迫下党参多糖合成的调控

2.3.1　党参多糖合成相关物质含量

干旱胁迫导致党参蔗糖、果糖含量及多糖总量降低，淀粉和多糖含量升高（图4）。硅抑制淀粉及党参多糖合成积累，但整体上促进党参多糖总量的增加（图4）。与干旱胁迫相比，硅处理下党参叶和根中蔗糖与果糖含量显著增加，淀粉及多糖含量显著下降；至14 d和21 d时，叶中蔗糖和果糖含量增幅最大，分别提高12.6%和31.8%；多糖和淀粉含量降幅最大，分别下降12.9%和17.7%。根中蔗糖和果糖含量分别至14 d和7 d时增幅最大，分别为54.4%与39.2%；多糖和淀粉含量分别至21 d和14 d时降幅最大，分别为19.9%与14.5%。

2.3.2　党参多糖合成相关酶活性

干旱胁迫导致党参蔗糖合成和分解代谢及淀粉分解代谢相关的SPS、SS、INV等基因表达下调和酶活性降低，淀粉合成代谢相关基因表达上调和酶活性升高（表1，图5）。硅通过促进SPS、SS、INV等蔗糖合成分解相关酶基因表达，促进蔗糖合成积累并分解为下游产物，同时抑制GBSS、SSS、AGPase等淀粉合成相关酶基因表达，促进α-淀粉酶及β-淀粉酶相关酶基因表达，抑制淀粉合成并促进其分解。硅对蔗糖合成和分解相关酶活性有正调控作用，与干旱胁迫相比，蔗糖合成和分解相关酶活性显著升高，干旱胁迫至21 d时，叶中SS、AI活性和根中SPS、AI活性分别增长83.2%、13.9%、23.4%、28.2%。与干旱胁迫相比，硅处理的植株淀粉合成相关酶活性显著下降，淀粉分解相关酶活性显著升高，其中至14 d时叶中GBSS、SSS及根中SSS活性显著下降，21 d时叶中GBSS、SSS及AGPase活性极显著下降；14 d时叶中β-淀粉酶活性及根中α-淀粉酶活性分别升高49.8%和17.8%。

2.4　硅对干旱胁迫下党参EMP及TCA相关物质含量、酶活性的调控

2.4.1　EMP及TCA相关物质含量

干旱胁迫导致EMP原料葡萄糖及TCA中间产物柠檬酸含量降低，EMP终产物丙酮酸含量增加（图6）。硅处理对EMP及TCA循环相关物质的调控效应大多于干旱处理14 d后出现显著差异。与干旱胁迫相比，硅处理下EMP相关物质含量减少，叶中葡萄糖和丙酮酸含量至21 d时分别下降6.2%和21.0%；同时，促进TCA循环相关物质积累，叶中柠檬酸含量至21 d时增加12.3%，根中柠檬酸含量至7 d时增加11.5%。

2.4.2　EMP及TCA相关酶活性

干旱胁迫导致EMP中HK、PFK、PK等葡萄糖分解相关酶基因下调，丙酮酸合成酶基因上调，调控葡萄糖分解酶活性下降及丙酮酸合成酶活性升高；同时，ICD、MDH基因表达上调导致TCA相关酶活性升高（表2，图7）。硅处理通过调控EMP及TCA循环中HK、PDH、ICD等酶基因表达，对EMP相关酶活性产生积极影响，促进EMP相关物质积累，同时抑制TCA相关酶活性，抑制柠檬酸分解，促进柠檬酸积累。施加硅后再进行干旱胁迫结果显示（表2，图7），硅对EMP相关酶活性整体有正调控作用，特别是叶中HK、PK及根中PFK、PK酶活性至21 d时分别提高17.1%、22.7%、14.3%和28.4%；同时，对TCA相关酶活性整体呈负调控作用，特别是叶中SDH酶活性至21 d时下降31.2%，MDH酶活性至7 d时下降30.2%，根中PDH酶活性至14 d时下降18.8%，SDH酶活性至7 d时下降25.7%，以及MDH酶活性至21 d时下降27.1%。

3 讨论

3.1　硅对党参生长发育及保水能力起正调控作用

植物生长状态是直观反映植物发育的重要指标，对环境变化较为敏感。水分参与植物生长、生理代谢过程，是影响植物生长状况的重要因子^［24］。大多数植物利用光合作用获得生长代谢原材料，通过合成蔗糖进而转化为一系列产物参与调控植物的生长代谢^［25］。本研究结果表明，干旱胁迫抑制党参生长，使根长、根粗减小，植株含水量减少；施加硅后根长、根粗受到的抑制有所缓解，表明硅对党参抵御干旱有促进作用。这一结果与前人^［26］对黄瓜（Cucumis sativus）幼苗的研究结果一致。干旱胁迫下党参叶片相对含水量降低，硅处理下植株叶片相对含水量显著升高，接近CK的水平，表明硅对党参保水能力有增强作用，这与前人^［27］研究的硅能增强番茄（Solanum lycopersicum）水分利用率的结果一致。同时干旱胁迫使党参叶片有明显稀疏、黄化现象，且对党参光合色素合成有明显抑制作用，具体表现在干旱后叶绿素含量明显减少；而在施加硅后，叶片稀疏、黄化现象有明显好转，叶绿素含量明显升高，表明硅对党参光合色素合成及光合作用有一定促进作用，与前人^［28］研究外源硅的施加可以增加大豆（Glycine max）叶绿素含量的结果一致，可以看到在受到干旱胁迫后植物体内类胡萝卜素含量升高，与尹莲等^［29］研究的类胡萝卜素作为抗氧化剂参与抵抗胁迫的结果相一致。综上所述，干旱胁迫对党参光合色素合成具有抑制作用，导致党参光合作用降低，抑制党参生长发育；硅对党参生长发育及保水能力及光合色素合成起到促进作用^［30］，可能的原因是施加外源硅提高了党参细胞间及细胞壁中“植硅体”含量^［12］，通过增强党参细胞壁强度，达到提高党参保水能力的目的，从而改善干旱胁迫下党参生长条件，促进党参生长发育，同时又正向反馈调节光合色素的合成，增强光合作用，对干旱胁迫下对党参生长发育起到良性循环的调控作用，进而增强党参抗旱性。

3.2　硅对党参多糖总量起正调控作用

党参多糖是党参次生代谢产物中重要的一类物质，主要通过蔗糖分解成各种中间物质后再经过糖基转移酶（GTs）的作用合成，是一类主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖等单糖构成的杂多糖多聚体^［31］，在党参体内参与细胞壁构成、抗氧化、抗胁迫等作用^［32-33］，也是评价党参药材质量的标志性物质。淀粉和党参多糖都是多糖，但在生理功能及结构组成上存在差异，因此本研究单独对这2类物质进行测定。代谢酶在上述物质合成与分解过程中扮演着重要角色，酶反应需要温和、稳定的环境，细微的环境变化能对酶活性及反应过程产生影响^［34］。本研究结果表明，干旱胁迫导致党参蔗糖合成相关SPS、SS基因表达下调，导致其活性减弱，同时分解相关INV基因表达上调，使得相关酶活性增强，促进蔗糖分解成果糖、葡萄糖、UDP-葡萄糖等多糖合成前体物质。干旱胁迫使得GBSS、SSS、AGPase等淀粉合成相关酶基因上调，α-淀粉酶、β-淀粉酶基因下调表达，促使淀粉合成相关酶活性增强，分解相关酶活性减弱，淀粉分解速率降低，促进叶和根中淀粉、多糖积累；施加硅后出现相反的结果，即叶和根中淀粉、多糖含量减少。多糖合成相关物质含量、酶活性及相关酶基因在干旱处理及施加硅后的变化表明，在干旱胁迫下，党参通过调控蔗糖、果糖及葡萄糖等物质转化关键酶基因表达来抑制自身生长发育所需物质合成通路，转而使更多的物质用于合成淀粉及多糖等，通过储存能量、增强细胞壁强度及抗氧化能力等方式应对干旱造成的损伤。因为硅的施加改善了党参体内水分状况，增加光合色素含量，调控蔗糖合成相关酶基因表达，导致蔗糖含量增加，进一步反馈调节下游基因表达促进蔗糖分解，分配更多能量用于合成党参生长发育所需物质，因此合成淀粉及多糖的原料减少，调控相关酶基因表达下调，酶活性下降，最终淀粉及党参多糖含量减少。干旱胁迫从各个方面抑制党参生长发育，导致党参生物量下降，即使干旱胁迫下党参根中多糖绝对含量升高，由于生长受到抑制最终多糖总量下降，而硅的施加改善了党参生长发育状态，使得党参生物量增加，单株多糖总量相对增加。

3.3　硅调控EMP及TCA循环中酶基因表达进而正调控党参抵御干旱能力

EMP和TCA是植物所需能量的重要来源，光合作用产物蔗糖水解后的葡萄糖或果糖通过EMP途径分解后在丙酮酸脱氢酶作用下进入TCA循环，最终生成ATP，从而将能量传输给代谢过程^［35］。本研究结果表明，受到干旱胁迫后，党参叶与根中丙酮酸含量升高，柠檬酸含量下降，EMP及TCA中PFK、PK、MDH等相关酶活性增强；施加硅后党参叶和根中丙酮酸含量下降，柠檬酸含量升高，EMP及TCA中相关酶活性减弱。在干旱胁迫下，党参通过提高EMP及TCA相关酶的活性和代谢强度，刺激蔗糖分解代谢及分解产物优先进入EMP及TCA途径，促进能量形成及释放，用于淀粉及多糖等物质的合成和积累，作为能量物质储存及应对干旱胁迫造成的细胞渗透伤害。施加外源硅可以促进党参体内形成“植硅体”，这有助于植物体修复和体内水分环境改善，从而提高光合作用效率，促进生长发育。随着生长发育所需营养物质需求的增大，淀粉分解、EMP及TCA产生的能量更多用于葡萄糖等营养物质的合成，而用于淀粉及党参多糖合成的能量减少，从而抑制淀粉及党参多糖合成积累。葡萄糖作为参与植物生长过程中重要的碳源，被用于合成其他有利于党参生长的物质，这使得进入EMP及TCA循环的物质减少，反馈调控党参EMP及TCA中的酶活性下降及基因表达下调，TCA循环减缓，导致TCA循环关键物质积累，最终导致淀粉及多糖合成所需原料和能量减少，使淀粉及党参多糖合成下调。有研究^［36］表明，柠檬酸对植物起到一定缓解胁迫损害的作用，因此，硅调控柠檬酸含量增加可能也是党参抵御干旱能力增强的原因之一。

4 结论

研究发现，干旱胁迫下，适当的硅处理可以缓解干旱造成的植物体损伤。硅处理通过增加叶片相对含水量及光合色素含量，对党参生长发育产生了积极影响，因此分配更多EMP及TCA产生的能量及葡萄糖等多糖合成前体物质用于其他营养物质合成，下调党参多糖合成。但因为党参生物量的增加，硅处理下多糖总量有所增加。因此，硅的施用可以在一定程度上增强党参抗干旱能力，提高党参产量和质量，为干旱地区党参提质增效提供理论依据。

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基金资助

甘肃省科技计划项目(22JR11RA111)

国家自然科学基金项目(81760683)

国家中药材产业技术体系建设专项资金项目(CARS-21)