兰州百合原生质体的分离纯化和应用

Protoplast Isolation, Purification and Application of Lilium davidii var. unicolor

摘要

该研究旨在建立兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）原生质体分离纯化体系，以促进其基因功能研究和体细胞杂交育种。通过研究材料选择、渗透压调节剂浓度、酶添加量、酶解时间和纯化条件等关键因素，确定了酶解法提取兰州百合原生质体的最优参数。结果表明：继代30 d左右的兰州百合无菌苗叶片，在0.4 mol⋅L^-1的甘露醇环境下，使用含15 g⋅L^-1的纤维素酶和5 g⋅L^-1的离析酶的酶解液酶解3 h，即能分离完整均一的兰州 百合叶肉原生质体，平均产量超过4×10⁶个⋅g^-1，且细胞活力超过90%。在0.4 g⋅mL^-1 PEG-4000介导下转染 35S：：GFP质粒15 min，成功获得阳性转化子。同时，在0.5 g⋅mL^-1 PEG-4000与5 mmol⋅L^-1 CaCl₂（pH=10）作用下，原生质体发生融合，形成双核细胞。该体系的建立为兰州百合体细胞杂交育种提供了高质量的细胞材料，也为其基因功能研究搭建了平台。

Abstract

To promote gene function research and somatic hybrid breeding， a protoplast isolation and purification system for Lilium davidii var. unicolor was established， and the optimal parameters for enzymatic hydrolysis of protoplasts were determined by investigating the key factors such as material selection， osmotic regulator concentration， enzyme dosage， enzymatic hydrolysis time， and purification conditions. The results demonstrated that the homogeneous mesophyll protoplasts were isolated from leaves sub-cultured for about 30 d and digested with the enzyme solution containing 15 g⋅L^-1 cellulase and 5 g⋅L^-1 segregation enzyme for 3 h in the presence of 0.4 mol⋅L^-1 mannitol， and the average yield was more than 4×10⁶ cells·g^-1 with the cell viability exceeding 90%. Positive transformers were obtained successfully by 35S：：GFP plasmids transfected with 0.4 g⋅mL^-1 PEG-4000 for 15 min. At the same time， the protoplasts fused to form binucleated cells by 0.5 g⋅mL^-1 PEG-4000 and 5 mmol⋅L^-1 CaCl₂， pH=10. This system provided high-quality cell materials for L. davidii var. unicolor protoplast fusion breeding and established a platform for gene function research.

Graphical abstract

关键词

兰州百合 / 原生质体 / 瞬时转化 / 化学融合

Key words

Lilium davidii var. unicolor / protoplast / transient transformation / chemical fusion

兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）是川百合（Lilium davidii）的变种，我国主要的食用百合品种之一，其鳞片洁白，含糖量高，粗纤维少，肉质细腻，应用于菜肴、甜品等^［1-2］，深受广大消费者的喜爱。百合中不仅有丰富的营养物质，还含有多糖、甾体皂苷、多酚、黄酮、生物碱等生物活性物质，具有一定的保健和药用价值^［3］。

植物原生质体是去除细胞壁的裸露细胞，可用于通过分子、细胞、生物化学、遗传、基因组和蛋白质组学方法进行的细胞试验，以分析不同信号通路和细胞器功能，并在研究植物胁迫感知和响应等方面有独特优势^［4］。基于适当的材料选择和提取手段，原生质体能够产生与完整组织和植物个体相似的生理反应，再现植物细胞内的调控过程，如亚细胞定位、启动子激活、蛋白质相互作用、蛋白分选、囊泡运输等^［5-6］。同时，原生质体也是体细胞融合培育新种质、制造“人工种子”的原始材料，能够一定程度解决自然种属间杂交不亲和的问题^［7］。兰州百合生长周期长、遗传转化研究困难，以植物原生质体为基础的瞬时表达技术（transient gene expression，TGE）因快捷、高效的特性，能在转化后较短时间内（几h至几d）得到基因活性表征^［8］。因此，构建一个高效的兰州百合原生质体分离与纯化体系，能够为其快速增殖、体细胞杂交等生物学操作提供细胞材料。同时，以此为基础构建的瞬时转化体系能够为兰州百合基因功能等研究提供快速有效的验证平台。

本研究基于酶解法分离原生质体，利用蔗糖梯度离心法纯化原生质体，通过筛选最佳分离材料、渗透压调节剂浓度、酶添加量、酶解时间和蔗糖浓度，建立兰州百合原生质体高效分离和纯化体系，并利用PEG-Ca²⁺法，对兰州百合原生质体进行瞬时转化和化学融合应用，证明兰州百合原生质体的稳定性和潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1　材料与试剂

1.1.1　植物材料

以保存于上海市农业科学院植物组培专业技术服务平台的兰州百合无菌苗叶片为试材。培养基采用MS固体培养基，添加蔗糖30 g·L^-1，琼脂 7 g·L^-1。培养条件为22 ℃，光照16 h/黑暗8 h，光照强度2 000~2 500 lx。继代2周后兰州百合幼苗叶片用于原生质体分离纯化。

1.1.2　试剂

本研究主要使用的试剂如下：甘露醇（D- Mannitol，DM），纤维素酶（R-10，Yakult，日本），离析酶（R-10，Yakult，日本），原生质体洗液（Cell Protoplast Wash Medium，CPW，含0.20 mmol·L^-1 KH₂PO₄，1.00 mmol·L^-1 KNO₃，10.00 mmol·L^-1 CaCl₂，2.00 mmol·L^-1 MgSO₄，1.00 μmol·L^-1 KI，0.16 μmol·L^-1 CuSO₄），纯化液（蔗糖质量浓度为230 g·L^-1的CPW溶液），转化液（0.40 g·mL^-1 PEG-4000， 0.10 mol·L^-1 CaCl₂和0.20 mol·L^-1 DM），融合液Ⅰ（50 g·mL^-1 PEG-6000），融合液Ⅱ（5.00 mmol·L^-1 CaCl₂，pH=10），孵育液WI（0.50 mol·L^-1甘露醇，4.00 mmol·L^-1 MES，20.00 mmol·L^-1 KCl）。

1.2　试验方法

1.2.1　原生质体分离

基于拟南芥（Arabidopsis thaliana）的原生质体分离方法^［9］，首先筛选作为原生质体提取材料的兰州百合最适组培苗苗龄。然后，调整甘露醇浓度、酶添加量和酶解时间等关键参数获得兰州百合原生质体分离的最优体系。选择不同继代时间（14、30、60 d）兰州百合叶片（图1），使用双面刀片将材料切成细丝状后，投入提前制备好的包含不同浓度甘露醇、纤维素酶和离析酶的CPW溶液中进行酶解处理（表1）。酶解液提前置于55 ℃水浴中孵育10 min，冷却到室温后过滤灭菌使用；25 ℃黑暗80 r·min^-1振荡酶解2~5 h后加入等体积的CPW溶液终止酶反应。通过75 μm细胞筛滤除未消化的叶片组织，将原生质体释放至50 mL圆底管中。通过较小的加速度在900 r·min^-1条件下离心5 min，去除上清液后用CPW溶液轻柔重悬原生质体。新制备的兰州百合原生质体重悬液置于冰上待纯化。

1.2.2　原生质体纯化

选择不同质量浓度的蔗糖溶液（表1）对新鲜制备的兰州百合原生质体进行纯化。吸取1 mL的原生质体悬浮液，缓慢滴入6 mL添加蔗糖的CPW中，900 r·min^-1离心5 min，小心吸出中间的原生质体层。纯化后，用无糖CPW漂洗1次，进行计数和细胞活力检测。

1.2.3　原生质体转化

用含0.4 mol·L^-1甘露醇的CPW溶液将纯化后的原生质体稀释至6×10⁵个·mL^-1，然后在100 μL原生质体中加入10 ng含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标签的无内毒素质粒，本研究中采用pNC-Amp-GFP载体^［10］。利用NC克隆模块将GFP基因连接在兰州百合生长调节因子基因LdGRF的N端，构建融合基因。原生质体和质粒轻弹混匀再加入等体积的转化液，共浴15 min。随后，加入1 mL CPW（含0.4 mol·L^-1甘露醇）终止反应，1 000 r·min^-1离心5 min，去除上清液。加入100 μL孵育液WI，25 ℃培养12 h后显微镜（Nikon Eclipse Ti-S）下观察。显微滤片选择TRITC通道检测自发荧光（EX 540/25，BA 605/55），eGFP通道检测激发荧光（EX 450-490，BA 500-550），DAPI通道检测核定位标志物（EX 340-380，BA 435-485）。

1.2.4　原生质体融合

参照化学融合试验方案^［11］，取纯化后的兰州百合叶片原生质体，用0.4 mol·L^-1 CPW洗液重悬，并稀释至2×10⁵个·mL^-1，在透明的培养皿中滴加0.5 mL原生质体稀释液，静置，使细胞均匀分布在培养皿上。向液滴缓慢加入等体积融合剂Ⅰ， 15 min后再加两倍体积的融合剂Ⅱ，静置10 min后重复3次添加融合剂Ⅱ。期间，通过倒置显微镜观察原生质体融合过程。

1.3　数据分析

采用细胞计数板进行兰州百合原生质体的计数。吸取定容后的原生质体悬浮液10 μL于细胞计数板正中央，计数标准单位体积内的细胞数目，每个试验组计数10次。原生质体产量=（标准单位体积的平均细胞数×悬浮液总体积）/叶片鲜质量。利用FDA所有试验数据，采用GraphPad Prism 8进行单因素方差分析（ANOVA）和绘图。均值比较采用Tukey’s multiple comparisons test （HSD）检验，P<0.05为显著性水平。

2 结果与分析

2.1　植物材料状态对原生质体分离效率和活性的影响

本研究中，用不同生长状态的兰州百合无菌苗叶片探究植物材料状态对于原生质体分离效率的影响。结果表明，叶片的幼嫩程度对兰州百合原生质体的分离效率和活性有一定影响（图2），30 d的叶片能够产生原生质体（1.19±0.29）×10⁶个·g^-1，细胞活性也能相对更好地维持，24 h细胞活性保持在80%以上。

2.2　渗透压调节剂浓度对原生质体分离效率和活性的影响

甘露醇是一种常见的细胞渗透压调节剂，在植物原生质体离体培养环境的构成中起到重要的作用。适宜的渗透压，有助于提高后续试验可靠性和原生质体的长期活力。兰州百合叶片原生质体直径大约在50 μm，最大的可以超过100 μm。试验中首先设置了0.3~0.7 mol·L^-1，浓度梯度为0.2 mol·L^-1的甘露醇处理试验（表1）。结果显示，较低的甘露醇浓度可更好地促进原生质体分离，维持细胞活力。然后，以0.2~0.5 mol·L^-1浓度梯度为0.1 mol·L^-1的甘露醇处理，结果（图3）显示，0.4、0.5 mol·L^-1甘露醇环境中原生质体分离效率均较高，分别达到（5.15±0.25）×10⁶、（5.16±0.37）×10⁶个·g^-1。其中0.4 mol·L^-1原生质体活性超过90%。因此，0.4 mol·L^-1甘露醇能够为兰州百合原生质体的分离和存活创造相对合适的渗透压环境。

2.3　酶添加量对原生质体分离的影响

植物原生质体分离主要是酶解细胞壁的过程，根据不同细胞壁组分，酶解过程中常见的酶有纤维素酶、果胶酶、离析酶等。本研究设置纤维素酶和离析酶的梯度组合（表1），统计原生质体产量和活性（图4）。结果发现，在15 g·L^-1的纤维素酶和5 g·L^-1的离析酶混合液中酶解可获得相对较多的兰州百合原生质体，达到（2.11±0.11）×10⁶个·g^-1。原生质体活力检测结果表明，10~15 g·L^-1的纤维素酶与5 g·L^-1的离析酶组合，分离的原生质体具有较高的活性，超过90%；在质量浓度为20 g·L^-1纤维素酶和10 g·L^-1离析酶的酶解液中分离得到的原生质体细胞活性仅有58.4%，显示高浓度的纤维素酶和离析酶对细胞可能具有毒害作用。

2.4　酶解时间对原生质体分离的影响

植物细胞壁能否被充分酶解也受到酶解时间的影响。按照试验设置的梯度酶解时间（2、3、4、5 h）进行试验，结果发现（图5），在添加15 g·L^-1纤维素酶和5 g·L^-1离析酶的情况下，2 h即可以分离得到（3.34±0.27）×10⁶个·g^-1兰州百合原生质体。随着酶解时间的增加，分离的原生质体量也逐渐增加，酶解3 h能够产生（4.31±0.46）×10⁶个·g^-1原生质体，酶解4 h能够产生约（4.95±0.20）×10⁶个·g^-1原生质体，达到最高值，并具有显著差异。原生质体活性检测结果显示，酶解3 h的细胞活性达到95.88%，酶解4 h的细胞活性已有降低趋势，为87.63%。随着酶解时间增加，分离得到的原生质体活性明显降低，酶解5 h，细胞活性不足80%。镜检显示有大量破碎原生质体，这也是产量下降的主要原因。因此，为了获得高活性兰州百合原生质体，酶解时间设置为3 h最佳。

2.5　纯化方式对原生质体质量的影响

离心法和界面法是2种常用的原生质体纯化方式，前者的细胞损失小，后者的杂质清除更彻底。由前期试验结果发现，原生质体会自发产生聚集，而残留的杂质会使细胞聚集的情况加剧。因此，为了尽可能去除杂质，设置4个蔗糖质量浓度梯度的纯化液，用同批原生质体进行纯化。结果表明（图6），所有质量浓度的蔗糖均能够有效去除悬浮液中的杂质，清除效率随着质量浓度升高而变高。但原生质体的数量和活性也受到明显影响，随着蔗糖质量浓度升高，纯化后的原生质体数量显著减少，且活性降低，特别是280 g·L^-1蔗糖溶液纯化后，细胞活性低于80.00%。综合细胞损失与活性变化情况可知，230 g·L^-1蔗糖溶液的纯化效果最好，原生质体数量为（2.72±0.37）×10⁶个·g^-1，细胞活性为96.00%。以上结果说明，利用230 g·L^-1蔗糖溶液进行纯化，能保持兰州百合原生质体的高活性，有利于下游应用。

2.6　兰州百合原生质体的应用

为了更好地验证兰州百合原生质体的应用效果，将新鲜分离的原生质体用于瞬时转化和体细胞融合。

2.6.1　瞬时转化

如图7所示，兰州百合原生质体能够通过PEG-Ca²⁺法瞬时转化带有绿色荧光蛋白标签的质粒，并正确表达。成功表达的空载体35S：：GFP因缺少定位信号，分布在原生质体的细胞膜、细胞质和细胞核等位置。成功表达融合载体35S：：GFP-LdGRF4的荧光聚集在细胞核，与核定位标志物DAPI的染色位置一致，这与LdGRF4是转录因子蛋白的特征相符。结果表明，该体系分离得到的兰州百合原生质体能够被用于亚细胞定位、BiFC等瞬时转化试验。值得注意的是，在多次转化中，阳性细胞通常具有较少的叶绿体，说明细胞的成熟度可能影响转化的最适PEG、Ca²⁺等因素。

2.6.2　体细胞融合

本研究利用融合剂处理分离得到的原生质体，观察到了细胞融合事件（图8）。图8C是多个细胞融合的例子，在悬浮液滴中，也有一些超过 3个细胞聚集融合的情况。图8D~8F是成对细胞在不同融合过程的状态，在融合剂Ⅰ的作用下， 2个细胞首先相互靠近，然后细胞膜接触。在融合剂Ⅱ的作用下，细胞膜发生破裂，2个细胞的细胞质进一步融合，呈现出葫芦形状。此时2个细胞的细胞核独立存在，并未发生融合。最后，2个细胞完全融合时，由于张力的作用，杂交细胞最终恢复成圆球状。此时细胞状态良好，可用于进一步的培养和再生。

3 讨论

通过使用纤维素酶、果胶酶等对细胞壁进行酶解，能够在产生大量原生质体的同时，保持细胞的形态和活力。基于酶解法的原生质体分离方法在不同植物中有一定差异，主要涉及分离材料的来源、预处理方式、渗透压调节剂浓度、酶解液中酶的种类和浓度比例、酶解时间等关键因素^［12］。酶对细胞的毒害作用，也要求分离后的原生质体必须经过纯化，才能更好地保持活性，用于下游试验。本研究以组培苗叶片为材料，探究了影响兰州百合原生质体产量和活性的各个因素，并通过亚细胞定位、细胞融合试验检验了原生质体的应用价值。

用于原生质体分离的材料通常有子叶、叶片、花瓣、愈伤组织等^［13-14］，兰州百合组培苗叶片能够全年稳定供应，因此可作为建立原生质体分离和纯化体系的植物材料。在不同日龄叶片试验中，本研究发现30 d左右的叶片有较高的原生质体产量，且24 h细胞活性更高；而14 d的叶片较小，生物量较少，提取时需要的组培苗数量更多；60 d的叶片产量较低，细胞活性不足70%，且叶片达到组培瓶瓶盖处，会出现尖部发黄，需要继代。因此，生长旺盛的兰州百合30 d左右的组培苗叶片作为分离原生质体的材料最为合适。

渗透调节剂（如甘露醇、山梨醇、蔗糖等）浓度会影响缓冲液的渗透压，只有在适宜的渗透压环境中，原生质层内外压才能保持稳定。理论认为，植物细胞最适渗透压一般在0.4~0.6 mol·L^-1的范围内^［15］，而在不同植物分离体系报道中，最适渗透压调节剂的添加浓度在0.3~1.0 mol·L^-1的范围^［12］。其中，甘露醇是使用最为广泛的一种渗透压调节剂。兰州百合的甘露醇浓度梯度试验结果表明，0.4 mol·L^-1甘露醇能够提供较为合适的渗透压环境，使分离的原生质体维持较好的状态。不同植物、同一植物不同组织来源的材料的最适渗透压都可能存在差异，拟南芥以0.4 mol·L^-1甘露醇最佳^［9］，杨树（Populus）则是0.6 mol·L^-1甘露醇最为合适^［16］，而萱草（Hemerocallis fulva）花瓣和叶片原生质体的最适山梨醇浓度分别为0.5、0.6 mol·L^-1［14］。这些材料来源的差异是最适渗透压不同的主要原因，可能与不同细胞的膜蛋白特征、内含物组成有关^［17］。

酶添加量和酶解时间是影响细胞壁酶解效率和细胞活性的重要因素，试验结果表明，采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10能够有效酶解兰州百合组培苗叶片细胞壁。在含15 g·L^-1纤维素酶和 5 g·L^-1离析酶的酶解液中酶解3 h即能获得超过 4×10⁶个·g^-1原生质体，且细胞活性大于90%。但随着酶解时间的增加，原生质体产量和细胞活性都先升高后下降，特别是酶解5 h，镜检观察到大量细胞碎片，这可能与酶的毒害有关。兰州百合最适的酶添加量与其他百合略有差异，细叶百合（L. pumilum）和铁炮百合（L. formosanum×L. longiflorum var. scabrum）分别是20 g·L^-1纤维素酶+5 g·L^-1离析酶+1 g·L^-1果胶酶和10 g·L^-1纤维素酶+5 g·L^-1离析酶+1 g·L^-1果胶酶^［18］。在原生质体分离中，纤维素的浓度对酶解效率有更大影响，这与以上几种百合最适离析酶浓度相似而最适纤维素酶有较大差异的情况相符^［19-20］。

在兰州百合原生质体刚被分离时，酶解液中存在大量杂质，主要包括未完全酶解的植物组织和细胞碎片。这些杂质会严重影响原生质体的活性和质量^［21］。在采用界面法纯化植物细胞时，通常会使用蔗糖质量浓度为250 g·L^-1的漂洗液^［22］。蔗糖也会改变溶液的渗透压，考虑到前期结果中0.4 mol·L^-1的最适甘露醇浓度较其他百合偏低^［23］，因此试验中设置了200~280 g·L^-1的蔗糖质量浓度。结果表明，兼顾纯化效果和原生质体损失，蔗糖质量浓度为230 g·L^-1的CPW更适用于兰州百合叶片原生质体的纯化。

分离纯化得到的兰州百合原生质体被应用于亚细胞定位和体细胞融合。2种应用都是基于PEG介导法，显微镜中能够观察到正确的荧光信号和细胞融合事件，说明由该体系得到的原生质体具有较好的质量。当然，原生质体的瞬时转化和融合也受许多因素影响，需要进一步探究最佳条件以提高转化和融合的效率^［24］。

4 结论

本研究建立了兰州百合的原生质体提取与纯化体系。利用继代30 d的组培苗叶片，在含 0.4 mol·L^-1甘露醇、15 g·L^-1纤维素酶和5 g·L^-1离析酶的酶解液中，黑暗振荡酶解3 h，即可得到 4×10⁶个·g^-1的原生质体。使用蔗糖质量浓度为230 g·L^-1的CPW洗液纯化后，可用于瞬时转化、细胞融合等下游试验。本研究为兰州百合基因功能的相关研究和体细胞杂交创制新种质奠定了基础。

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基金资助

上海市“科技创新行动计划”农业科技领域项目(22N11900300)

上海市中央引导地方科技发展资金项目(YDZX20223100003004)

上海市专业技术服务平台能力提升项目(21DZ2292300)