循环复幼对水曲柳生长繁殖及生理的影响

Effects of Cycle Rejuvenation on Growth, Reproduction and Physiology of Fraxinus mandshurica

摘要

为解决水曲柳（Fraxinus mandshurica）因年龄效应而导致的插穗生根能力在3年生后显著下降的问题，以4年生水曲柳实生苗为研究对象，探究循环扦插复幼对克服年龄效应的作用，尤其是循环次数和截干处理2个关键因素对水曲柳萌蘖、生长和扦插生根的影响，以及循环复幼过程中水曲柳的生理变化。结果表明：循环复幼次数的增加和截干处理都能提高水曲柳的复幼程度，呈现萌生枝数量增加、枝条细化、茎节缩短的特征，同时显著提高扦插再生能力。在循环复幼次数达到3次且叠加截干处理时，与未循环复幼相比萌枝数量提高了6.56倍，生根率提高了7.44倍。循环复幼1~3次，植株生长素吲哚乙酸（IAA）、细胞分裂素（CTK）水平提高，赤霉素（GA₃）水平在第3次时才显著提升，而脱落酸（ABA）水平呈逐渐下降趋势；循环复幼后植株中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，丙二醛（MDA）和可溶性糖含量减少。这些生理指标变化都与植株幼化状态相符。可见，循环复幼可有效恢复幼化状态，诱导水曲柳形成较高IAA、GA₃和较低ABA水平的萌枝，同时降低了抗氧化酶活性、MDA与可溶性糖含量，有利于实现水曲柳复幼，从而提高扦插生根率，实现水曲柳良种的快速高效无性繁殖。

Abstract

To address the problem of the rooting ability of Fraxinus mandshurica cuttings significantly decreasing after three years due to age effect， four-year-old F. mandshurica seedlings were used to investigate the role of cycle rejuvenation through cuttings in overcoming age effect in this study. The impact of the number of cycles and topping treatment on the sprouting， growth， and rooting of F. mandshurica cuttings， as well as the physiological changes during its rejuvenation process were examined. The results showed that the measurement of increasing the number of rejuvenation cycles and topping treatment both enhanced the degree of rejuvenation in F. mandshurica， which were characterized by an increased number of sprouted branches， finer branches， and shorter internodes， while significantly improved the regeneration ability of the cuttings. When the number of rejuvenation cycles reached three and was combined with topping treatment， the number of sprouted branches increased by 6.56 times， and the rooting rate increased by 7.44 times compared to non-rejuvenated treatment. During one to three rejuvenation cycles， the indole acetic acid（IAA） and cytokinin（CTK） levels in the plants increased， the gibberellin（GA₃） levels significantly increased only at the third cycle， and the abscisic acid （ABA） levels decreased gradually. After rejuvenation， the activities of catalase（CAT）， peroxidase（POD）， and superoxide dismutase（SOD） and the contents of malondialdehyde（MDA） and soluble sugars decreased in the regenerated plants. These physiological changes were consistent with the juvenile state of the plants. Cycle rejuvenation can effectively restore the juvenile state， induce the formation of sprouts with higher IAA and GA₃ levels and lower ABA levels， and simultaneously reduce the oxidative state and soluble sugar content in F. mandshurica. These changes are beneficial for achieving rejuvenation of F. mandshurica， thereby increasing the rooting rate of F. mandshurica cuttings and enabling rapid and efficient clonal propagation of superior F. mandshurica varieties.

Graphical abstract

关键词

水曲柳 / 复幼 / 扦插 / 激素 / 抗氧化酶活性 / 可溶性糖含量

Key words

Fraxinus mandshurica / rejuvenation / cutting propagation / hormones / antioxidant enzyme activity / soluble sugar content

水曲柳（Fraxinus mandshurica）为木犀科（Oleaceae）梣属（Fraxinus）阔叶乔木，广泛分布于我国东北的大兴安岭东部、小兴安岭、长白山等地^［1］，是国家储备林计划重要的大径级用材树种，国家二级保护树种，与胡桃楸（Juglans mandshurica）、黄檗（Phellodendron amurense）共称为“东北三大硬阔”^［2-3］。水曲柳生长快、适应性强，树干通直、纹理美观、材质坚硬致密，是制造家具、船舶、机械的重要原料，也是重要的特殊建筑材料，具有重要的经济和生态价值^［4-5］。

水曲柳的繁殖方式主要有种子繁殖、萌芽更新、扦插、嫁接。目前，生产上大规模繁殖主要依赖种子繁殖，但是种子繁殖个体间遗传性状差异较大，造林后林木分化严重，且种子繁殖需要进行人工催芽，发芽时间长、幼苗期长。扦插是可以用于规模化生产的一种无性繁殖方式，具有操作简单、成苗快、应用广泛等优点，可应用于水曲柳这种难生根树种的繁殖。但水曲柳不定根再生能力受年龄效应影响显著，插穗的生根能力大幅度下降^［6］。有报道^［7-8］表明，连续复幼能够有效克服多年生树木无性繁殖的年龄效应。连续循环复幼是从无性繁殖成活的苗木上再取插穗、接穗和芽等进行下一轮繁殖，每一轮称为一次复幼，每轮都从新复幼成功的插穗、接穗或嫩枝上取样本进行下一轮复幼。140年生欧洲落叶松（Larix decidua）的茎尖经过10次连续继代培养后产生不定根，在14次继代培养后针叶呈现幼年形态，具有较高的生根率和成活率^［9］。将麻栎（Quercus acutissima）成熟无性系连续嫁接到幼龄砧木上，恢复了生根能力^［10］。近年来，越来越多的报道解析了糖对于促进植物成熟的作用。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）生长发育中糖既作为能量源，又作为信号分子，调控植物的生长发育、应激反应和衰老过程^［11］。microRNA156（miR156）是植物从幼年期向成年期转变的分子标尺^［12-13］，植物越幼嫩miR156含量越高，同时糖水平越低，且miR156含量的增加可被外源葡萄糖所抑制。在介导拟南芥从营养相转向成熟的众多叶片信号中，糖是一个重要的组成部分^［14-15］。

目前，水曲柳复幼研究鲜见报道。因此，本研究以4年生水曲柳实生苗为试验材料，探究循环复幼次数和截干处理对水曲柳生长和扦插繁殖的影响，以期克服无性繁殖的年龄效应，为无性繁殖工厂化、规模化提供技术支撑。同时，分析循环复幼有关生理指标变化，为水曲柳复幼研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1　试验材料

选择生长状态良好的4年生水曲柳实生苗为循环复幼研究对象，所有试验材料均为课题组在前期科研试验中获得，并栽植于东北林业大学帽儿山实验林场。

1.2　试验方法

1.2.1　循环复幼及扦插

试验于2020—2023年进行。于2020年6月初对4年生水曲柳截干促萌，1个月后取半木质化枝条做穗，进行嫩枝扦插；2021年开始，每年6月对成活的扦插苗截干促萌，并于1个月后从当年萌发嫩枝取穗扦插；每轮扦插成活称为1次循环复幼，连续进行3次循环复幼。同时，每次循环复幼都保留未截干的试验材料作为对照。每个处理30株，重复3次。截干高度距地面15 cm，截干切口水平，并在切口刷上油漆，防止树干失水。

循环复幼扦插方法：插穗长度5~8 cm，保留 1个叶片和1个芽点，叶片修剪为菱形，扦插基质选用沙土，所有插穗基部用200 mg∙L^-1的IBA浸泡30 min。扦插后保证大棚内温度在25~35 ℃，湿度80%~90%，每隔7 d喷施1次稀释1 000倍的多菌灵溶液。

1.2.2　生长指标调查

每次循环复幼均在当年7月初扦插前调查未循环复幼处理和循环复幼处理1~3次的萌枝数量，以及新生枝长度、直径、茎节数量和茎节间距等生长指标。

1.2.3　插穗生根指标调查

每年循环复幼均在扦插后30 d调查未循环复幼处理、循环复幼处理1~3次及对照未截干处理的插穗生根率、主根数量、平均根长、不定根发生时间，以此分析水曲柳插穗的生根情况。

1.2.4　生理指标测定

在每次循环复幼当年7月初扦插当天，对未循环复幼和循环复幼1~3次的水曲柳萌发枝条取样，测定植物内源激素含量、过氧化物酶（POD）活性、可溶性糖和可溶性蛋白含量。吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA₃）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。丙二醛（MDA）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、过氧化物酶试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（WST-8法）、可溶性糖含量试剂盒、BCA法蛋白含量检测试剂盒等均购买于苏州格锐思生物科技有限公司。

1.3　数据分析

在本研究中，数据统计通过Excel 2021完成，利用SPSS 27.0软件单因素检验中的邓肯模型比较差异显著性（P<0.05），使用GraphPad Prism 8软件作图，图中误差线代表标准误，样本数量3个以上，重复3次。

2 结果与分析

2.1　循环复幼对水曲柳生长的影响

由图1可知，4年生水曲柳经过3次循环复幼后萌枝数量逐渐增多，新生枝长度减小、茎杆逐渐变细，茎节间距减小、数量无显著变化，茎皮、叶片颜色由之前的暗绿色转变为嫩绿色，叶片变小。

由图2可知，截干处理促进了萌蘖，与未截干的对照植株相比，循环复幼1~3次植株截干后的萌枝数量分别提高了3.89倍、5.44倍、6.56倍，但新生枝长度、直径、茎节间距整体上低于未截干植株。之后再针对截干分析循环复幼次数对生长的影响。结果显示：循环复幼1~3次的萌枝数量较未循环复幼分别提高了1.10倍、1.76倍、2.24倍；但萌条的生长均低于未循环复幼的新生枝，循环复幼1~3次的新生枝长度较未循环复幼的依次降低了24.39%、27.55%、32.56%，新生枝直径依次下降了18.50%、38.18%、47.72%，茎节间距依次下降了19.08%、18.48%、17.59%。由此表明，随循环复幼次数增加，水曲柳萌枝数量逐渐增加，新生枝长度、直径、茎节间距逐渐减小，呈现幼化状态，复幼水平不断提高，繁殖再生能力增强。

2.2　循环复幼对水曲柳插穗生根的影响

由图3可知，截干处理提高了水曲柳插穗的生根率，与未截干的对照植株相比，循环复幼1~3次植株截干后的插穗生根率依次提高了19.46%、12.73%、10.65%，但主根数量、平均根长、不定根发生时间与未截干处理无显著差异。截干处理后，循环复幼1~3次的水曲柳插穗生根率与未循环复幼相比分别提高了1.42倍、3.02倍、4.78倍，主根数量依次增加27.46%、122.95%、214.34%，平均根长依次提高77.63%、158.90%、242.47%；循环复幼2、3次的不定根发生时间比未循环复幼分别缩短了12.71%、27.79%。与未循环复幼相比，随着循环复幼次数的增加，水曲柳插穗生根率逐渐提高，主根数量、平均根长逐渐增加，不定根发生时间逐渐缩短。由此表明，随循环复幼次数增加，水曲柳生根能力不断提高，由于水曲柳生根受年龄效应影响显著，因此，生根指标的提高标示了每年循环扦插对幼化水平的逐渐提升，从而有效克服了年龄效应。

2.3　循环复幼对内源激素的影响

不同循环复幼次数下水曲柳内源激素含量见图4。结果发现，与未循环复幼相比，随循环复幼次数增加IAA含量提高、ABA含量降低，CTK含量在循环复幼1次后显著升高，但循环复幼1~3次的CTK含量之间无显著性差异；GA₃含量在循环复幼0~2次处理间无明显差异，但第3次循环复幼显著高于对照。由此说明，复幼次数的累积导致复幼程度越高的植株的IAA和GA₃含量越高、ABA含量越低，CTK含量维持在相对较高的水平。

2.4　循环复幼对抗氧化酶的影响

生命代谢过程中，过氧化物积累是引起细胞老化和凋亡的关键因素。MDA是植物膜脂过氧化的主要产物，膜脂过氧化越严重，MDA含量越高。CAT、POD、SOD作为维护膜系统的保护性酶，主要功能是清除过氧化物，通常情况下，过氧化物的含量与这些酶的活性成正比。由图5可知，随着循环复幼次数增加，MDA含量显著下降，与未循环复幼相比，循环复幼1~3次的MDA含量依次下降了31.76%、42.90%、63.28%。随着循环复幼次数增加，CAT、POD、SOD酶活性逐渐降低，与未循环复幼相比，循环复幼1~3次的CAT活性依次下降了15.32%、28.53%、33.65%，POD活性依次下降了8.98%、22.93%、30.42%，SOD活性依次下降了65.50%、73.17%、78.89%。

2.5　循环复幼对营养物质的影响

可溶性糖和可溶性蛋白都是维持生命活动和调控发育的重要组成部分。由图6可知，随着循环复幼次数增加，可溶性糖、蔗糖含量变化显著，呈现逐渐下降趋势，与未循环复幼相比，循环复幼1~3次的可溶性糖含量依次下降了11.13%、19.97%、30.16%，蔗糖含量依次下降了2.79%、11.54%、16.56%，这与植物的幼化特征相符。但随着循环复幼次数的增加，可溶性蛋白含量无显著变化。

3 讨论

树木通常在幼龄期具有良好的不定根发生能力，然而随着树龄增大其插穗形成不定根的能力也逐渐下降^［16］。复幼能够使植物细胞、组织或器官的特征部分或全部恢复到其幼龄阶段，进而提高植株的再生能力^［17］。通常用萌蘖数量、生根率、成活率等指标来评价树木的无性繁殖能力^［18-19］，本研究以萌蘖数量和扦插繁殖生根率作为水曲柳的主要繁殖和复幼指标，观察3次循环复幼过程中水曲柳的繁殖能力和复幼水平变化。

宋晓波^［20］在研究核桃（Juglans regia）复幼过程发现，植物复幼后能够提高繁殖再生能力，并且连续复幼处理后繁殖再生能力逐渐提高，成龄植株连续嫁接达到10次后状态接近1年生幼态材料水平，生根率最高可达到98.5%，起始生根时间显著缩短。郜伟等^［21］对珠美海棠（Malus zumi）进行1、3、5、7代组培继代复幼后发现，组培可以使珠美海棠复幼，继代次数的增加有利于复幼。本研究也发现循环复幼能恢复4年生实生幼树的幼化表型，显著提高生根率，经过连续3次循环扦插复幼后，水曲柳萌枝数量由平均1.00个增加达到7.56个，嫩枝扦插的生根率由复幼前的6.77%上升到57.14%，萌枝数量、生根率与未截干且未循环复幼的水曲柳相比分别提高了6.56倍、7.44倍。由此说明，循环复幼可以提高水曲柳复幼程度和繁殖再生能力。本研究发现，无论水曲柳是否截干，在循环复幼次数增加后，都能大幅提高其复幼程度和繁殖再生能力，表明循环复幼次数增加是水曲柳复幼程度和繁殖再生能力提高的主要原因。

一般来说，幼嫩植株通常具有更强的再生能力^［22-23］，这是因为幼嫩植株细胞分裂活跃，组织生长迅速，植物IAA含量较高，这些因素使得幼嫩植株更容易进行再生繁殖^［24-25］。本研究发现，循环复幼后水曲柳插穗生根率显著提高，证明植株的复幼水平提高，水曲柳茎段内源激素中IAA、CTK、GA₃增加，ABA下降。苹果（Malus pumila）的组培继代复幼中，高浓度IAA和低浓度ABA对复幼有促进作用^［26］，本研究也得到类似结果。在含有CTK的培养基中，大桉（Eucalyptus grandis）外植体芽的连续继代培养可以诱导复幼^［27-28］。从激素生理作用看，IAA与GA₃都能够刺激细胞和茎段伸长，促进萌蘖；ABA能够引起芽休眠、叶子脱落，抑制细胞生长，植物激素之间相互作用，共同调节着植物的生长和形态发育，这说明促进水曲柳复幼的关键在于调控IAA、CTK、GA₃维持在较高水平，ABA保持在较低水平。

活性氧（ROS）广泛存在于植物生长发育过程。在低浓度下，ROS可作为信号分子参与细胞增殖和基因表达调控等过程；在高浓度下，ROS可以导致细胞损伤，诱发氧化应激，损伤细胞膜、蛋白质和DNA，最终导致细胞凋亡或坏死。在植物的整个生命周期中，较高含量的ROS是导致植物生理老化的一个重要因素^［29］。本研究发现，随着循环复幼次数增加，膜脂过氧化主要产物之一的MDA含量显著降低，同时CAT、POD、SOD等抗氧化酶活性也呈降低趋势。植物生理年龄越大，过氧化物含量越高，抗氧化酶活性也相应提高。循环复幼后，因植株过氧化物含量减少，抗氧化酶活性降低，可能是其对抗氧化酶需求产生了变化。Wang等^［30］在研究水曲柳花发育时发现，ROS在柱头发育过程中积累，在花粉萌发和花粉管伸长时迅速下降，授粉后ROS积累减少，ROS水平降低增加了成熟柱头中的花粉数量，加速了花粉管生长，似乎ROS的降低为新一代的发育创造条件。低水平ROS对植物至关重要，尤其是在幼年旺盛生长期，使得细胞免受损害，当ROS水平提高时，抗氧化机制被激活以清除ROS。本研究确定了包括SOD在内的几种酶活性随着复幼次数的增加呈下降趋势，也间接印证了活性氧水平随着循环次数增加而降低，恢复了幼年的生长活力，这预示着基于活性氧作用机制的调控林木复幼理论与技术将是进一步研究的方向。

糖也调控着植物成熟的转变。Yang等^［14］对拟南芥施加外源葡萄糖或蔗糖处理后，降低了miR156水平，加速了拟南芥从幼年期向成年期转变。Yu等^［15］发现，当拟南芥的光合作用受到抑制时，幼年期延长，且miR156表达量升高。光合作用产物（糖代谢物）通过调节拟南芥中miR156的水平参与发育阶段的调节^［31］。本研究发现，随着循环复幼次数的增加，可溶性糖和蔗糖的含量呈逐步下降趋势，而复幼程度逐渐提高。糖代谢物含量的提高对水曲柳复幼有抑制作用，这表明通过降低光合作用产物（糖代谢物）含量有可能促进水曲柳复幼，建议可通过遮阴、调节光周期、控制温度、施用光合作用抑制剂等措施降低植物的光合作用，减少糖的积累，加快复幼。

循环复幼解决了水曲柳扦插生根繁殖年龄效应瓶颈和穗条产量问题，为水曲柳优良基因型的无性繁殖提供了技术支撑。同时，观察循环复幼后内源激素水平、过氧化物含量、抗氧化酶活性、营养物质含量等生理指标的变化可为多年生水曲柳提供关键的幼化和繁殖指标，为完善林木复幼技术和机制奠定基础。

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基金资助

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