冬凌草体细胞胚诱导及其组织细胞学观察

Somatic Embryo Induction and Histocytological Observation of Isodon rubescens

摘要

为建立冬凌草（Isodon rubescens）体细胞胚发生体系，更好地发挥在中医药学中的价值，促进资源稳定和利用，以冬凌草叶片为外植体，脱分化形成胚性愈伤组织，进一步增殖，诱导发育出体细胞胚，结合石蜡切片技术对冬凌草胚性愈伤组织及各阶段体胚进行组织细胞学观察，并探讨激素对植株再生的影响。结果表明：在B5+1.0 mg·L^-1 2，4-D培养基中，叶片可脱分化形成淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织；在MS+1.0 mg·L^-1 2，4-D+ 0.2 mg·L^-1 6-BA培养基中，胚性愈伤组织增殖效果最好，净增殖量最大可达2.81 g；在体胚诱导中，最佳培养基为MS+1.5 mg·L^-1 TDZ+0.2 mg·L^-1 NAA，诱导率最高为91.33%；在MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 IBA培养基中，表面含体细胞胚的胚性愈伤组织可分化出小植株；在组织细胞学观察中，胚性愈伤组织呈淡黄色或黄白色颗粒状，细胞核大且明显，其内部观察到外起源和内起源2种体胚发生方式，后期可发育为球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚或成簇状胚结构，内含淀粉粒。该研究成功建立了冬凌草间接体胚发生体系，为优化冬凌草胚性愈伤组织的“质”与“量”奠定基础，也为其分子育种及体胚技术研究提供了理论依据。

Abstract

Establishing the somatic embryogenesis system of Isodon rubescens to give full play to its value in traditional Chinese medicine， and promote the stability and utilization of its resources. The leaves of I. rubescens were used as explants to dedifferentiate into embryonic callus and further proliferate to induce somatic embryo. The histological and cytological observation of embryonic callus and somatic embryo at each stage was made by paraffin section， and the effect of hormones on plant regeneration was tested. The results showed that in B5+1.0 mg·L^-1 2，4-D medium， leaves could dedifferentiate into light yellow and granular embryonic callus. In MS+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 6-BA medium， the embryogenic callus had the best proliferation effect， and the maximum net proliferation was 2.81 g. The optimal medium for somatic embryo induction was MS+1.5 mg·L^-1 TDZ+0.2 mg·L^-1 NAA， and the highest induction rate was 91.33%. In MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 IBA medium， embryogenic callus containing somatic embryos could differentiate into small plants. In histological observation， the embryonic callus was yellowish or yellowish white granules with large and obvious nuclei. Two kinds of somatic embryogenesis were observed in the inner and outer origin of the callus， and the later developed into spherical， heart-shaped， torpedo-shaped， cotyledon-shaped embryo or cluster embryo structures containing starch granules. This study successfully established the indirect somatic embryogenesis system of I. rubescens， which laid a foundation for optimizing the “quality” and “quantity” of embryogenic callus， and also provided the theoretical basis for the research of molecular breeding and somatic embryo technology.

Graphical abstract

关键词

冬凌草 / 胚性愈伤组织 / 体细胞胚 / 组织细胞学

Key words

Isodon rubescens / embryonic callus / somatic embryo / histocytology

冬凌草（Isodon rubescens）为唇形科（Labiatae）香茶菜属多年生草本植物或亚灌木，也被称为冰凌草、彩花草等^［1］，分布于我国甘肃、陕西、河南等黄河流域，现被收载于《中国药典》^［2］。冬凌草有清热解毒、活血止痛的功效，其中的萜类化合物在抗肿瘤、抗癌等方面有着积极的影响^［3］，临床上常用于治疗咽喉肿痛、支气管炎、蛇虫咬伤和肝癌等病症^［4］，然而市场上冬凌草质量参差不齐，品种匮乏，传统培育方法难以保持其优良性状。因此，发挥冬凌草在中医药学中价值，促进资源稳定和利用，需建立起高效稳定的冬凌草再生体系。植物离体再生包括器官发生和体胚发生2种途径，体胚发生途径是植物体细胞在一定条件下未经过精卵细胞融合而成为与合子胚相似的结构，并以与合子胚相似的方式发育新个体的形态形成过程^［5］，与器官发生相比，速度快，变异性低^［6］。体胚发生途径包含直接和间接2种发生方式，直接发生即外植体不经愈伤组织直接在外植体表面形成体细胞胚；间接发生需要在形成胚性愈伤组织的基础上，诱导其分化出体细胞胚，通过进一步发育最终成为植株^［7］。由于体胚发生途径具有成苗周期短，遗传相对稳定，且分化过程不用诱导生根等优势^［8］，因此成为当前研究热点。近年来，基于体细胞胚发生途径的植株再生体系建立已成功应用于沿阶草（Ophiopogon bodinieri）^［9］、五味子（Schisandra chinensis）^［10］、无患子（Sapindus saponaria）^［11］等药用植物上。对于冬凌草组织培养方面的研究主要集中在以种子繁殖^［12］及以愈伤组织直接进行器官发生^［13］等方面，而利用叶片诱导胚性愈伤组织，通过体胚发育实现植株再生的研究鲜有报道。本研究以前期诱导得到的冬凌草试管苗叶片为外植体，通过间接体胚发生方式探讨体胚发生途径，从而激发植物体细胞内部类似合子胚一样的潜能，对揭示体细胞胚发生与发育机理，深入开展细胞分化、发育、形态发生、细胞学观察等重大理论问题研究具有重要参考价值。此外，可为冬凌草种质资源保存、人工种子制作以及基因工程中转基因受体和突变体筛选等提供良好的试验体系^［14］。

1 材料与方法

1.1　材料与试剂

试验中所用冬凌草叶片取自实验室前期得到的无菌苗。试验所用2，4-D（2，4-dichlorophenoxyacetic acid）、6-BA（6-benzyladenine）、NAA（1-Naphthaleneacetic acid）等组培试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司，TDZ（Thidiazuron）购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2　胚性愈伤组织诱导

取无菌苗叶片剪切为0.5 cm²左右大小。（1）筛选诱导胚性愈伤组织的最适基本培养基，将外植体分别接种于MS（Murashige and Skoog）、1/2MS（1/2 Murashige and Skoog）、WPM（Woody Plant Medium）、B5（Gamborg B5 Medium）培养基中，培养基中2，4-D质量浓度为1.0 mg·L^-1。（2）以B5为基本培养基，设2，4-D质量浓度0.1~2.0 mg·L^-1，同时添加 30 g·L^-1蔗糖、6 g·L^-1琼脂，pH调至6.8~7.2，确定2，4-D最适质量浓度。以上均黑暗培养，每瓶接种5片，每个处理5瓶，重复3次。观察愈伤组织的生长情况。

1.3　胚性愈伤组织增殖

选取B5培养基初步诱导的淡黄色、颗粒状、质地松散的胚性愈伤组织0.3 g左右，分成5~6块，转接至含不同质量浓度的6-BA、2，4-D、NAA上进行培养，附加30 g·L^-1蔗糖、6 g·L^-1琼脂，以上处理设置3次重复。pH调至5.8~6.2，在26 ℃条件下暗培养，及时观察胚性愈伤组织的长势情况，30 d后分别称量质量，统计增殖倍数，确定最适宜胚性愈伤组织增殖的激素配比。

1.4　体细胞胚诱导

将增殖后长势良好的胚性愈伤组织接种至MS基本培养基，分别添加1.0~3.0 mg·L^-1 TDZ以及不同浓度TDZ、NAA组合，每个处理5瓶，每瓶接愈伤组织6团，重复3次。每天16 h光照下进行培养诱导，培养45 d后统计体胚诱导率。

1.5　植株再生

选取长势良好且表面带有体胚的胚性愈伤组织，转接于MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA、MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 IBA、MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.2 mg·L^-1 NAA，附加30 g·L^-1蔗糖、6.0 g·L^-1琼脂。培养30 d后统计成苗率。

1.6　体胚发生过程形态学及组织细胞结构观察

胚性愈伤组织诱导及其体胚分化期间形态学均采用体视显微镜观察，同时采用石蜡切片法^［15］对材料依次进行FAA固定、乙醇梯度脱水、透明、二甲苯浸蜡、包埋、修蜡、切片、染色等步骤，染色采用PAS-萘酚黄染色法（淀粉粒呈紫红色，细胞壁呈紫红色，蛋白质呈黄色），以上步骤完成后封片，通过显微镜镜检，并进行图像采集分析。

1.7　数据处理

试验数据采用SPSS 21.0统计分析软件进行显著性分析，统计指标如下：

愈伤组织诱导率=（脱分化形成愈伤组织的外植体数量/接种的外植体总数量）×100%（1）

胚性愈伤组织诱导率=（脱分化形成胚性愈伤组织的外植体数量/接种的外植体总数量）×100%（2）

胚性愈伤组织增殖倍数=［（增殖后的胚性愈伤组织质量-接种的愈伤组织质量）/接种的愈伤组织质量］×100%（3）

体胚诱导率=（产生体胚的愈伤组织团数量/接种愈伤组织团数量）×100%（4）

成苗率=（生成植株的含体胚块数量/接种的含体胚块数量）×100%（5）

2 结果与分析

2.1　不同基本培养基对冬凌草愈伤组织诱导的影响

将叶片接种至含1.0 mg·L^-1 2，4-D的不同基本培养基中暗培养30 d后发现，各培养基下愈伤组织生长情况差异明显（表1），诱导率都为100%。MS培养基诱导的愈伤组织呈白色，启动最早，但整体质地偏硬，结构紧密；B5培养基诱导的愈伤组织状态启动较晚，10 d左右启动，生长较为缓慢，呈现淡黄色颗粒状，初步判定为胚性愈伤组织，适宜后期继代增殖；1/2MS培养基诱导的愈伤组织部分水渍状，少部分产生绒毛状不定根，随着诱导时间的延长，逐步褐化，不适合进一步的继代；WPM培养基上诱导的愈伤组织培养15 d左右便出现褐化现象，且质地偏硬，不适宜继代。

2.2　2，4-D质量浓度对冬凌草胚性愈伤组织诱导的影响

以B5为基本培养基诱导得到淡黄色、质地较疏松、表面呈颗粒状的愈伤组织。当2，4-D质量浓度处于0.1~1.0 mg·L^-1范围内，愈伤组织诱导率随质量浓度提高呈升高趋势，质量浓度为0.1、 1.0 mg·L^-1时差异显著（P<0.05）；当质量浓度处于1.0~2.0 mg·L^-1范围内，诱导率随质量浓度提高逐渐下降，各诱导率间差异显著（P<0.05）；当质量浓度为1.0 mg·L^-1时，诱导率达最高（93.33%）（表2），因此最适2，4-D质量浓度设为1.0 mg·L^-1。

2.3　胚性愈伤组织增殖

将胚性愈伤组织（图1A）接种至含不同激素配比的继代培养基上，增殖结果见图1B和表3。当在原诱导培养基中添加较低质量浓度6-BA时，增殖倍数提高，在1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.2 mg·L^-1 6-BA时，增殖净质量达到最大，增殖过程中，7~28 d增殖速度较快，30 d后愈伤组织增殖速度渐缓，愈伤组织呈黄白色、质地松散，表面有丝状伸出（图1C）。2，4-D质量浓度为2.0 mg·L^-1时添加少量的6-BA，愈伤组织增殖净质量最少，基本停止生长且态由淡黄色、松散颗粒状转为乳白色、紧实块状。当降低2，4-D质量浓度至0.2 mg·L^-1，升高6-BA质量浓度至1.0 mg·L^-1时，虽有增殖，但随着时间的延长，增殖至21 d时出现褐化现象。当6-BA与NAA结合使用时，虽增殖倍数较高，但愈伤组织整体向乳白色紧实块状转化，后期无法诱导出胚状体。

2.4　体胚诱导

将增殖良好的胚性愈伤组织继代培养在无激素MS培养基上，逐渐变褐死亡（图2A）；在MS培养基中添加不同质量浓度的TDZ、NAA激素，细胞继续保持活力，表面小的颗粒状突起进一步发育，约30 d后在愈伤组织表面可观察到单个球形胚或心形胚（图2B），随着时间的延长，也会出现鱼雷胚及子叶胚，且体型趋于饱满，子叶生长无规则，同时在体胚发生过程中，也会有畸形胚形成，其形态各异，常见的有连体畸形胚、子叶畸形胚（图2C~2F）。试验结果显示，无论是单一添加TDZ还是TDZ与NAA结合，均有体胚出现，且在单一添加TDZ，质量浓度高于2.5 mg·L^-1时，出胚率降低；当激素组合为MS+1.5 mg·L^-1 TDZ+0.2 mg·L^-1 NAA时，愈伤组织表面的颗粒状凸起最为明显，体胚诱导率达到最高，为91.33%（表4）。

2.5　植株再生

将表面含体胚的胚性愈伤组织接种至MS添加激素组合0.5 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 IBA的培养基时，培养30 d左右出现体细胞胚再生小植 株，培养45 d左右有根的分化（图3A），未分化出植株的愈伤组织呈褐色，质地变得更为松软；当接种至MS添加激素组合0.5 mg·L^-1 6-BA+（0.1 mg·L^-1、0.2 mg·L^-1）NAA时，含体胚的胚性愈伤组织表面仅有丛生芽的分化，未发育成小植株（图3B），且分化的丛生芽均为无根，易与表面分离。各培养条件下成苗率及生长状态见表5。

2.6　体胚发生组织细胞学观察

通过石蜡切片技术观察显示，冬凌草体胚起源于愈伤组织中的胚性细胞，表现为细胞核大且明显，细胞排列紧密，间隙小，细胞质浓厚（图4A），此时细胞处于不断分裂状态，呈现显著的分生细胞特征，可由单细胞原胚分裂成2-细胞原胚或多细胞原胚（图4B、4C），周围可观察到淀粉粒。观察到2种体胚发生方式，分为内起源和外起源2种，在冬凌草胚性愈伤组织中发现多个内起源和外起源形成的球形胚（图4D、4E）。从体细胞胚切片可观察到不同形态的胚状体，有脱离母体的心形胚（图4F）、向子叶胚转化的鱼雷形胚（图4G）及畸形胚（图4H）。此外，在子叶胚发育后期，还观察到维管束样结构（图4D、4I）。

3 讨论

3.1　间接体胚发生过程的影响因素

在植物间接体胚发生技术中，诱导胚性愈伤组织是基础，体胚形成是关键。生长素和细胞分裂素的不同类型和比值影响着细胞分裂、分化及形态改变^［16］。有研究^［17］指出，2，4-D是诱导胚性愈伤组织的常用激素，可单独添加，也可与其他激素共同使用。薛敏等^［18］诱导油用亚麻（Linum usitatissimum）胚性愈伤组织时发现，在添加2，4-D、IAA和NAA 3种生长素时，仅在2，4-D条件下能诱导出胚性愈伤组织，且在其中添加酪蛋白水解物，诱导效果不如单独使用2，4-D，表明2，4-D是其胚性诱导阶段的重要激素。王晓春等^［19］研究也显示，适宜的2，4-D质量浓度在植物胚性愈伤组织诱导和体细胞胚早期发育过程中起着重要作用，加入一定量的细胞分裂素6-BA对胚性愈伤组织形成也有一定的辅助作用。本研究以2，4-D的常用质量浓度0.1~2.0 mg·L^-1为参考进行试验发现1.0 mg·L^-1 2，4-D对胚性愈伤组织的诱导率最高。在附加 0.2 mg·L^-1 6-BA时，胚性愈伤组织增殖倍数可达最高，且随着继代增殖，胚性愈伤组织转化为浅黄或黄白色疏松颗粒状。由此可见，加入细胞分裂素较好地维持了愈伤组织的胚性化效果。

除此之外，由于不同培养基所含的矿物质元素种类和浓度存在差异^［20］，因此对于不同品种的植物材料一般采用的基本培养基类型都会有所差异，其类型影响着胚性愈伤组织的诱导及体胚的后续形成。B5培养基诱导的愈伤组织常用于细胞悬浮培养，且相比其他培养基而言铵含量较低，而高含量的铵可能对某些培养物的生长起抑制作用。本试验中，冬凌草在添加2，4-D均为1.0 mg·L^-1条件下，B5培养条件可诱导出胚性愈伤组织，生长状态良好。张媛媛等^［21］研究王枣子（I. amethystoides）胚性愈伤组织诱导和增殖中有类似结果。

有了形成体胚的前提条件，在进一步诱导体胚过程中也受到多重因素的影响^［22］。适宜的培养基以及激素种类与浓度可获得更多的体细胞胚^［23］。研究^［24］显示，多数植物体细胞胚的诱导使用的是MS培养基，因其含有的营养元素相对比较全面，对多数植物的体细胞胚发生具有促进作用。TDZ是体胚诱导常用激素，或单一使用或与其他激素结合使用，具有细胞分裂素活性和生长素效果，发挥的作用因材料而异^［25］。吴丽芳等^［26］通过对比6-BA和TDZ 2种激素，发现TDZ对白刺花（Sophora davidii）体细胞胚发生有促进作用。杨先泉等^［27］探究TDZ对非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha）叶外植体体细胞胚发生的效应发现，单独使用NAA时，仅得到非胚性愈伤组织，当加入TDZ时，可诱导胚性愈伤组织及体胚发生，表明适宜的TDZ与NAA浓度在加快体细胞胚发育进程，提高体细胞胚发生率方面发挥重要作用。本研究中，通过添加单一激素TDZ，其质量浓度在1.5 mg·L^-1时，体胚诱导率较高，且与NAA结合使用时，在0.2 mg·L^-1 NAA附加下达到最高体胚诱导率。

本研究虽然借鉴冬凌草器官发生的成苗理论，得到了再生植株，但由于体胚发育条件的限制，体胚成苗率并不高，后期仍需深入探讨适宜的体胚成苗培养方式。

3.2　体胚发生组织细胞学观察

胚性愈伤组织在颜色、形态方面可能因为物种的不同呈现出差异。荆茹月等^［28］在对香樟（Cinnamomum camphora）胚性和非胚性愈伤组织差 异研究中观察到胚性愈伤组织多为白色，且表 面颗粒状明显。本研究得到的冬凌草胚性愈伤组织为淡黄色颗粒状，且通过细胞学观察发现内部胚性细胞排列紧密，细胞核明显，并观察到2种体胚起源方式，细胞内有淀粉粒的存在，为胚状体的形成和发生速度提供保障^［29］。在进一步的体胚发育过程中，出现维管束的分化，这一发育也是形成胚状体的重要标志^［30］。此外，体细胞胚不像合子胚发育那样规范，畸形胚的出现是常见现象^［31］，降低畸形胚的发生率也是未来值得进一步研究的问题。

本研究以冬凌草叶片为外植体成功诱导出胚性愈伤组织，且通过进一步培养获得了体细胞胚和再生植株，这对开展冬凌草胚性愈伤组织诱导研究，以及通过体胚发生途径建立再生体系，进而推动分子育种、遗传转化等方面的研究具有重要意义。

参考文献

[1] 高世勇，唐博琪，魏新瑞，等.冬凌草的本草考证、化学成分、药理作用及其临床应用［J］.中草药，2023，54（19）：6543-6554.

[2] GAO S Y， TANG B Q， WEI X R，et al.Textual research， chemical composition， pharmacological effects and clinical applications of Rabdosia rubescens ［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2023，54（19）：6543-6554.

[3] 张婉晴，夏小婧.冬凌草化学成分及药理作用研究进展［J］.云南化工，2020，47（10）：17-19.

[4] ZHANG W Q， XIA X J.Advances in studies on chemical components and pharmacological effects of oridonium［J］.Yunnan Chemical Technology，2020，47（10）：17-19.

[5] 孔睿，潘鹏宇，梁国标.冬凌草素药理作用及机制的研究进展［J］.中华中医药学刊，2021，39（11）：70-72.

[6] KONG R， PAN P Y， LIANG G B.Research progress on pharmacological role and mechanism of oridonin［J］.Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2021，39（11）：70-72.

[7] 陈川川，刘越，郭凤仙，等.冬凌草生物学研究进展［J］.湖北农业科学，2016，55（19）：4901-4906.

[8] CHEN C C， LIU Y， GUO F X，et al.Progress of biological research for Rabdosia rubescens ［J］.Hubei Agricultural Sciences，2016，55（19）：4901-4906.

[9] 李美莹，李前，金子涵，等.蒙古栎体细胞胚胎发生技术研究［J］.辽宁林业科技，2021（1）：1-6.

[10] LI M Y， LI Q， JIN Z H，et al.Study on somatic embryogenesis of Quercus mongolica ［J］.Liaoning Forestry Science and Technology，2021（1）：1-6.

[11] 李志芬，杨扬，由香玲，等.通过体细胞胚发生快繁优良刺五加植株的技术［J］.东北林业大学学报，2012，40（10）：19-21.

[12] LI Z F， YANG Y， YOU X L，et al.Rapid propagation of Eleutherococcus senticosus via somatic embryogenesis［J］.Journal of Northeast Forestry University，2012，40（10）：19-21.

[13] 魏冬霞，张滕，郑严仪，等.芍药愈伤组织中体细胞胚发育过程的组织细胞学观察［J］.植物研究，2018，38（1）：56-63.

[14] WEI D X， ZHANG T， ZHENG Y Y，et al.Histocytology observation on the somatic embryogenesis in herbaceous peony callus［J］.Bulletin of Botanical Research，2018，38（1）：56-63.

[15] VERGNE P， MAENE M， GABANT G，et al.Somatic embryogenesis and transformation of the diploid Rosa chinensis cv Old Blush［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2010，100（1）：73-81.

[16] 梁慧敏，杜雪玲，夏阳，等.沿阶草体细胞胚诱导及快繁技术研究［J］.安徽农业科学，2021，49（24）：136-140.

[17] LIANG H M， DU X L， XIA Y，et al.A rapid propagation potocol of Ophiopogon japonicus via somatic embryo culture in vitro ［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2021，49（24）：136-140.

[18] 张苏苏，孙丹，艾军，等.黑暗处理对五味子体细胞胚再生及其生理特性的影响［J］.植物生理学报，2022，58（5）：864-872.

[19] ZHANG S S， SUN D， AI J，et al.Effects of dark treatment on somatic embryo regeneration and physiological characteristics of Schisandra chinensis ［J］.Plant Physiology Journal，2022，58（5）：864-872.

[20] 邢建宏，彭漳清，刘希华，等.无患子优树叶片体细胞胚胎发生及植株再生的研究［J］.三明学院学报，2014，31（6）：93-100.

[21] XING J H， PENG Z Q， LIU X H，et al.Somatic embryogenesis and plant regeneration from the elite Tree’s leaves of Sapindus mukorossi ［J］.Journal of Sanming University，2014，31（6）：93-100.

[22] 徐莉莉，聂世现，黄文静，等.冬凌草组织培养及其愈伤组织诱导研究［J］.生物学杂志，2010，27（3）：24-26.

[23] XU L L， NIE S X， HUANG W J，et al.Research on tissue culture and callus induction of Rabdosia rubescens（Hcnsi） Hara［J］.Journal of Biology，2010，27（3）：24-26.

[24] 苏秀红，董诚明，王春雷，等.冬凌草离体培养体系的建立及主要次生代谢产物的测定［J］.西北植物学报，2008，28（2）：310-316.

[25] SU X H， DONG C M， WANG C L，et al.Establishment of culture system of Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara and content of the main secondary metabolites in its regenerated plantlets［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2008，28（2）：310-316.

[26] 刘宝骏，刘国锋.安祖花胚性愈伤组织诱导及植株再生研究［J］.热带亚热带植物学报，2018，26（4）：407-414.

[27] LIU B J， LIU G F.Studies on embryogenic callus induction and plant regeneration of Anthurium andreanum ［J］.Journal of Tropical and Subtropical Botany，2018，26（4）：407-414.

[28] 梁忠泉，袁昌隆，张宝贺.微小组织石蜡切片制作体会［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2018，27（4）：368-373.

[29] LIANG Z Q， YUAN C L， ZHANG B H.Experience in making microtissue paraffin section［J］.Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry，2018，27（4）：368-373.

[30] 任毓辉，聂帅，彭春雪，等.红松胚性愈伤组织增殖的激素配比、糖源类型和增殖周期效应研究［J］.植物研究，2022，42（4）：704-712.

[31] REN Y H， NIE S， PENG C X，et al.Effects of hormone combinations，carbon source type and proliferation cycle on embryogenic callus proliferation of Pinus koraiensis ［J］.Bulletin of Botanical Research，2022，42（4）：704-712.

[32] 许丁帆，刘艳军，陶则满，等.番茄胚性愈伤组织诱导与增殖研究［J］.天津农学院学报，2020，27（3）：22-25.

[33] XU D F， LIU Y J， TAO Z M，et al.Study on embryogenic callus induction and proliferation of tomato［J］.Journal of Tianjin Agricultural University，2020，27（3）：22-25.

[34] 薛敏，高艳芳，朱磊磊，等.油用亚麻胚性愈伤组织的诱导及组织细胞学分析［J/OL］.分子植物育种.（2022-09-28）［2024-01-24］.

[35] XUE M， GAO Y F， ZHU L L，et al.Induction and histocytological observation of embryogenic callus from oil flax［J/OL］.Molecular Plant Breeding.（2022-09-28）［2024-01-24］.

[36] 王晓春，高婷，杨炜迪，等.紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导及胚状体分化研究［J］.作物杂志，2023（4）：98-103.

[37] WANG X C， GAO T， YANG W D，et al.Study on embryogenic callus induction and embryoid differentiation of alfalfa［J］.Crops，2023（4）：98-103.

[38] 高芳，沈海龙，刘春苹，等.红松成熟胚愈伤组织诱导外植体选择及培养条件优化［J］.南京林业大学学报（自然科学版），2017，41（3）：43-50.

[39] GAO F， SHEN H L， LIU C P，et al.Optimization of culture conditions and selection of suitable explants for callus induction from mature embryo of Pinus koraiensis ［J］.Journal of Nanjing Forestry University（Natural Sciences Edition），2017，41（3）：43-50.

[40] 张媛媛，朱智慧，张苗苗，等.培养基类型和植物生长物质浓度对王枣子愈伤组织诱导和继代的影响［J］.世界科学技术-中医药现代化，2020，22（8）：2851-2856.

[41] ZHANG Y Y， ZHU Z H， ZHANG M M，et al.Effect of medium type and plant growth substance concentration on callus induction and subculture of Isodon amethystoides ［J］.World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica，2020，22（8）：2851-2856.

[42] 姜治国，马鑫，胡胜，等.三叶木通体细胞胚胎发生及植株再生研究［J］.西南林业大学学报（自然科学），2022，42（3）：34-41.

[43] JIANG Z G， MA X， HU S，et al.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration of Akebia trifoliate ［J］.Journal of Southwest Forestry University（Natural Sciences Edition），2022，42（3）：34-41.

[44] NATARAJAN N， SUNDARARAJAN S， RAMALINGAM S，et al.Efficient and rapid in-vitro plantlet regeneration via somatic embryogenesis in ornamental bananas（Musa spp.）［J］.Biologia，2020，75（2）：317-326.

[45] ASLAM J， KHAN S A， CHERUTH A J，et al.Somatic embryogenesis，scanning electron microscopy，histology and biochemical analysis at different developing stages of embryogenesis in six date palm（Phoenix dactylifera L.） cultivars［J］.Saudi Journal of Biological Sciences，2011，18（4）：369-380.

[46] 安文杰，王银杰，刘清泉，等.马蔺幼胚高效再生体系的建立［J］.植物研究，2023，43（3）：333-339.

[47] AN W J， WANG Y J， LIU Q Q，et al.Establishment of an efficient regeneration system in Iris lacteal var. chinensis with immature embryo［J］.Bulletin of Botanical Research，2023，43（3）：333-339.

[48] 吴丽芳，魏晓梅，陆伟东.白刺花胚性愈伤组织诱导和植株再生体系建立［J］.植物生理学报，2019，55（2）：218-224.

[49] WU L F， WEI X M， LU W D.Embryogenic callus induction and establishment of plant regeneration system of Sophora davidii ［J］.Plant Physiology Journal，2019，55（2）：218-224.

[50] 杨先泉，姚丽君，倪苏，等.TDZ对非洲紫罗兰叶外植体体细胞胚发生的效应［J］.西南农业学报，2010，23（6）：2030-2033.

[51] YANG X Q， YAO L J， NI S，et al.Effect of thidiazuron on somatic embryogenesis of African violets leaf explants［J］.Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2010，23（6）：2030-2033.

[52] 荆茹月，霍坤，李志辉.香樟胚性与非胚性愈伤组织 间的差异研究［J］.中南林业科技大学学报，2020， 40（10）：70-78.

[53] JING R Y， HUO K， LI Z H.Difference between embryogenic and non-embryogenic callus of Cinnamomum camphora L.［J］.Journal of Central South University of Forestry and Technology，2020，40（10）：70-78.

[54] 项伟波，赵金凯，吴家胜，等.香榧体细胞胚发生、发育的形态与细胞学观察［J］.园艺学报，2015，42（8）：1477-1486.

[55] XIANG W B， ZHAO J K， WU J S，et al.Morphological and cytological observation of somatic embryogenesis and development in Torreya grandis ‘Merrillii’［J］.Acta Horticulturae Sinica，2015，42（8）：1477-1486.

[56] 马镇荣，刘卫，王昌虎，等.香根草体细胞胚胎发生的细胞学特点与形成条件［J］.生态学报，2003，23（7）：1290-1296.

[57] MA Z R， LIU W， WANG C H，et al.Cytology observation and formation conditions of somatic embryogenesis in Vetiveria zizaniodes ［J］.Acta Ecologica Sinica，2003，23（7）：1290-1296.

[58] 孔冬梅，沈海龙，冯丹丹，等.水曲柳体细胞胚与合子胚发生的细胞学研究［J］.林业科学，2006，42（12）：130-133.

[59] KONG D M， SHEN H L， FENG D D，et al.Cytological investigation of somatic and zygotic embryogenesis of Fraxinus mandshurica ［J］.Scientia Silvae Sinicae，2006，42（12）：130-133.

基金资助

国家自然科学基金项目(81173486)

河南省科技研发计划联合基金项目（优势学科培育类）(232301420078)