濒危植物光叶蕨的珠芽形成与特征

Gemmae Formation and Characteristics of the Endangered Plant Cystopteris chinensis

摘要

珠芽胎生繁殖是蕨类植物孢子繁殖的有益补充，丰富了植物的繁殖再生系统，影响着种群遗传多样性和对环境的适应能力。该研究以国家Ⅰ级重点保护野生植物光叶蕨（Cystopteris chinensis）为对象，通过形态学与解剖学方法，探究其羽片后面不明突起——珠芽的形态与解剖特征，揭示其生殖结构和发育过程，追溯珠芽胎生起源和生态适应机制。结果显示：（1）珠芽和孢子囊群同期出现在光叶蕨羽片背面末级细脉中部，只是珠芽位于顶端裂片。珠芽形成包括启动期、膨大期和成熟期3个时期，由黄绿色球状体逐渐成长为深绿色纺锤状，基部变黑形成离层时成熟。（2）珠芽起源于维管束鞘延伸区的薄壁细胞，不断分裂生长形成珠芽原基，逐渐突破叶下表皮形成圆球形珠芽；随着珠芽不断膨大，中下部细胞分化形成贮藏细胞和维管束，顶端分化出生长点形成芽。（3）极少数珠芽在叶片上可直接萌动形成新的自养个体。成熟珠芽掉落在土壤内1周后开始萌发，基部长出圆柱形根，顶部萌发出拳芽。残留珠芽第2年仍可萌发形成新叶，与茎芽产生的叶片形态有别。

Abstract

Viviparous reproduction is a beneficial supplement to spore reproduction of pteridophytes， which enriches the reproduction and regeneration system and affects the population genetic diversity and environmental adaptability. In this study， Cystopteris chinensis， a national key protected wild plant， was selected as materials， and morphological and anatomical methods were used， the morphological and anatomical characteristics of the gemmae with the unknown process behind the pinna were examined， and the reproductive structure and development process were revealed， and the viviparous origin and ecological adaptation mechanism of the gemmae were traced. The results showed that： （1）The gemmae and sporangium groups appeared in the middle of the last veins on the abaxial leaf pinna， but the gemmae were located in the apical pinnate lobes. The gemmae formation included three stages： initiation， expansion and maturation， the gemmae gradually grew from yellow-green globule to dark green spindle-shaped， and matured when the base turned black to form a separate layer. （2）The gemmae originated from the parenchyma cells in the extension area of the vascular bundle sheath， which continuously divided and grew to form the gemmae primordium， and gradually broke through the lower epidermis of the leaf to form spherical gemmae. With the gemmae expansion， the middle and lower cells differentiated into storage cells and vascular bundles， and the apex differentiated into growth points to form buds. （3）Few gemmae could directly sprout on the leaves to form new autotrophs. After falling to the soil for 1 week， the mature gemmae began to germinate， which grew cylindrical roots at the base， and the fist bud germinated at the top. The residual gemmae still germinated into new leaves in the second year， which were different from those produced by stem buds.

Graphical abstract

关键词

光叶蕨 / 珠芽 / 解剖结构 / 营养体胎生

Key words

Cystopteris chinensis / gemmae / anatomical structure / vegetative viviparity

蕨类植物是起源古老的原始维管植物，生长发育具有较强的可塑性，除孢子繁殖外，还存在珠芽繁殖、分株繁殖和无融合生殖等繁殖方式，形成了许多独特的适应机制^［1-2］。一些蕨类植物能产生珠芽或芽胞，它由营养体分化而来，遗传性状稳定，个体发育较成熟，容易生根，脱离母株后能迅速生长发育为新植株^［3］。蕨类及石松类植物中能进行珠芽繁殖的种类较多^［4］，例如珠芽狗脊（Woodwardia prolifera）、胎生铁角蕨（Asplenium indicum）、芽胞蹄盖蕨（Athyrium clarkei），但对于珠芽生殖的发育生物学研究目前仅见长柄石杉（Huperzia javanica）^［5］、亮叶石杉（H. lucida）^［6］、顶芽狗脊（W. unigemmata）^［7］和稀子蕨（Monachosorum henryi）^［8］等。珠芽的胎生繁殖丰富了植物繁殖途径，有利于种群的传播、扩散和数量增加，增强植物对生态环境的适应性。同一植株内无性繁殖和有性繁殖间存在权衡关系，对孢子繁殖困难的物种来说，珠芽无性繁殖是孢子有性繁殖的有益补充，但这种无性繁殖会降低种群的遗传多样性，进而影响物种对变化环境的适应能力^［9-10］。研究蕨类植物的珠芽形态、位置和发育等特征对于理解其系统发育、种群特征和生态适应等具有重要意义。

光叶蕨（Cystopteris chinensis）为冷蕨科（Cystopteridaceae）冷蕨属（Cystopteris）植物，中国特有蕨类植物，国家Ⅰ级重点保护野生植物，在《中国物种红色名录》中被列为极危（CR）等级，仅零散分布于四川省天全县和峨眉山市两地。通过多年野外调查和幼苗培育发现，光叶蕨羽片背部的不明突起为珠芽，它可以发育成新植株，且与孢子囊群属于同期发育，表明其可能存在兼性生殖^［11］。目前，光叶蕨的相关研究仅限于生长习性^［12-13］和分类学^［14］探讨，对珠芽生殖繁育特征的研究较少。本研究利用形态学与解剖学方法，探究光叶蕨珠芽的形态与解剖特征，揭示生殖结构和发育过程，追溯蕨类植物的珠芽胎生起源及其生态适应机制。

1 材料与方法

1.1　材料采集

试验材料来自四川省天全县二郎山光叶蕨野生植株，在不破坏植株情况下，采集不同发育时期的珠芽，迅速用45%FAA固定液（V（乙醇）∶V（乙酸）∶V（甲醛）=45∶6∶5）固定，置于冰箱中0~4 ℃冷藏备用。成熟珠芽种植于实验室光照培养箱中，定期观察珠芽形态及生长变化。

1.2　形态发育特征观察

采用肉眼观察或体式显微镜（LEICA S8APO，德国）观察、拍照，记录珠芽发育过程中的位置、时间和形态变化。

1.3　解剖结构特征观察

采用常规石蜡切片法在生物显微镜下观察样本解剖结构特征。通过乙醇梯度脱水—二甲苯透明—浸蜡包埋等处理，用徕卡RM2235切片机切片，再经历粘片、展片、脱蜡、复水、染色和封片等程序，自然晾干后保存在阴暗干燥环境中，Olympus BX53生物显微镜下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1　光叶蕨珠芽的形成与形态

光叶蕨在3月中旬开始萌芽，经大约45 ｄ的生长后，幼叶长度达20~30 cm时，小羽片背部逐渐长出珠芽。珠芽着生于羽片顶端裂片的末级细脉中部，整齐排列在羽片中脉两侧。在珠芽发育的同时，羽片下部裂片上的孢子囊群也正常发育（图1A~1C）。每个小裂片上着生1粒珠芽，一个羽片上多则6~8粒珠芽，一片叶上可着生40~80粒。珠芽在母体上不断长大，当生长至直径4~5 mm时，顶端萌发出叶芽，有的还长出须状不定根，与母体接触部位逐渐变黑，最终断裂脱离母体后长成独立植株。

珠芽形成分为启动期、膨大期和成熟期3个时期：4月下旬，叶片背面末级细脉中部有凸起、微小、淡绿色透明球状体出现，即早期珠芽结构，这一时期称为珠芽启动期（图1D~1F）。5月下旬，球状体珠芽变为绿色水滴形，长4~5 mm，宽2~3 mm，这一时期称为珠芽膨大期（图1G~1I）。7月中下旬，珠芽为深绿色纺锤状，与叶面接触处变为黑褐色，顶端出现芽分化，周围可见不定根，此时珠芽已逐渐成熟；直至9月中旬，叶片枯黄，珠芽中断其与母体叶片的结构联系而自然掉落，这一时期为成熟期（图1J~1L）。

2.2　光叶蕨的珠芽发育与解剖特征

光叶蕨叶脉维管束为周韧型维管束，外围分布着一些薄壁组织。珠芽起源于维管束鞘延伸区的薄壁细胞（图2A），结构发育过程可划分为启动期、膨大期和珠芽成熟期3个时期。

珠芽发育的启动细胞为维管束外周的4~5层薄壁细胞，启动细胞先垂周分裂，再平周分裂，细胞数量增加并形成细胞团，不断分裂生长形成珠芽原基，即叶脉处出现无结构分化的球形凸起结构；表皮及其下1~2层细胞与其下的薄壁细胞具有较明显的细胞间隙，薄壁细胞逐渐发育成为表皮衍生结构，包围着珠芽原基；间隙内部的1~2层薄壁细胞与原基联系紧密，后发育形成珠芽原 基的表皮细胞。珠芽原基细胞直径小、细胞核 浓密，继续分裂生长，突破表皮衍生结构包围形 成表面凸起的原基结构，外部薄壁细胞层数增加，逐渐突破叶下表皮形成淡绿色、细小、圆球形 珠芽。这一时期为珠芽启动期，又称原基发育期（图2B）。

随着珠芽不断膨大，中部细胞逐渐分化形成贮藏细胞和维管束，顶端逐渐分化出生长点，形成顶端分生组织（图2C）。成熟的珠芽内部薄壁细胞含有大量的营养物质，有较强大的贮藏功能，顶端生长点逐渐分化成芽（图2D）。

珠芽表面光滑，横切面呈圆形（图2E），由外到内依次是表皮、薄壁组织和维管组织。表皮由1层椭圆形细胞组成，细胞小，大小均匀、排列规则且紧密。表皮以内为数层薄壁细胞组成的薄壁组织，多数薄壁细胞内含有着色较深的淀粉颗粒状贮藏物；细胞无胞间隙，细胞质浓，细胞核相对体积大，非波型紧密排列。维管组织位于珠芽中央，维管束基部与叶脉维管束紧密相连；在珠芽发育后期分体中柱一分为二，近似圆形，呈“八”字形排列，每个分体中柱即1个周韧型维管束（图2F）。

2.3　光叶蕨珠芽的萌发生长

在秋季满足水分供应且温度适宜的条件下，极少数珠芽在叶片上可直接萌动形成新的自养个体（图3A）。少数成熟珠芽掉落在土壤内1周后开始萌发，首先从珠芽基部长出1~2条圆柱形根，直径约1 mm（图3B）。珠芽顶部中心的幼芽萌发形成极小的拳芽，1 d左右展开形成扇形叶，叶片顶端3裂，继续生长分裂，形成第1对羽片；继续向上生长，依次分化出第2对、第3对羽片，直至长大形成完整植株（图3C）。

珠芽萌发产生的种苗经过1 a生长，第2年从根状茎的茎芽处萌发出明显的拳芽，3~7 d新叶完全展开；残留珠芽仍可继续萌发形成新叶，大小与茎芽形成的营养叶相似，但形态上有所不同，茎芽形成的叶片裂片明显披针形，更窄长，而珠芽发育成的叶片裂片稍宽大些（图3D）。植株高20~ 30 cm，羽片30对左右时，叶的大小和形态接近于成熟孢子体营养叶。

3 讨论

3.1　珠芽着生位置

蕨类植物除通过孢子繁殖后代外，有的通过珠芽直接发育成新的植株，具有特殊的胎生现象。成熟珠芽在母体枯黄叶片上可直接发育长出1枚有柄的匙形幼叶，落地后长成新植株，或者珠芽基部与母体组织间形成离层后断裂，落地后再发育成完整植株。蕨类植物的珠芽多数在茎或叶柄、叶片或羽片中脉、叶轴与羽轴的交接处及叶片边缘处着生^［4，15］，外部通常密被鳞片，如蹄盖蕨属（Athyrium）、耳蕨属（Polystichum）、铁角蕨属（Asplenium）、三叉蕨属（Tectaria）、铁线蕨属（Adiantum）、过山蕨属（Camptosorus）、双盖蕨属（Diplazium）、狗脊属（Woodwardia）、番桫椤属（Cyathea）、碗蕨属（Dennstaedtia）和稀子蕨属（Monachosorum）等部分植物，冷蕨属个别种类如珠芽冷蕨（Cystopteris bulbifera）、犹他冷蕨（Cystopteris utahensis）和田纳西冷蕨（Cystopteris tennesseensis）也会在叶轴上形成珠芽^［14］，以上珠芽与叶背的孢子囊群位置明显不同，并且不是同期出现。

光叶蕨珠芽位于羽片背面末级小脉处，和孢子囊群同期出现在叶脉维管束处，这与珠芽狗脊和东方狗脊（W. orientalis）的珠芽情况相似^［7］。珠芽狗脊和东方狗脊的珠芽都生于羽片表面中脉两侧的网脉交叉点，与羽片背面同一位置的孢子囊群相对应。光叶蕨珠芽位于羽片上部远轴面的叶脉，孢子囊群在羽片下部近轴面的叶脉，它们都通过基部维管组织与叶脉相连，这样能优先、快速地获得养料，从而保证后代有效繁衍。光叶蕨珠芽与孢子囊群在脉序位置有所不同，但都具有繁殖特性。因此，珠芽可能是叶脉上孢子囊异常发育而形成的营养繁殖器官^［16］。

光叶蕨珠芽与孢子囊群同期发育且位置相似，两者是共存互补关系，存在一定营养竞争，狗脊属和蹄盖蕨属植物中也存在相似情况^［7，17］。珠芽发育的地方，孢子囊群就不能正常发育，珠芽的形成会抑制孢子囊群发育；羽片上着生的孢子囊群数量越多，珠芽数量就相对较少，反之亦然。珠芽/孢子囊群的数目与植株营养状况、环境状况等相关，它们数目的增加，对水分和养分的需求也会增加^［18］。野外观察发现，同一光叶蕨居群中有些植株具有发育珠芽，有些珠芽和孢子囊群同时存在，而另一些植株却不具珠芽。营养供应差的植株，珠芽/孢子囊群会减少，甚至没有。光叶蕨这种珠芽与孢子囊群之间协调发育的特殊情况，可能是一种灵活多变的繁殖策略，是长期适应环境的结果^［10］。

3.2　珠芽形态解剖特征

不同植物珠芽在不同发育阶段的形状、颜色等基本特征存在多样性，稀子蕨、单芽狗脊等植物在启动、膨大和成熟3个时期分别为黄绿色、绿色和棕色，基部形成离层后自然掉落^［7-8］。光叶蕨珠芽从产生到成熟过程中，先由透明黄绿色转为绿色，成熟时为深绿色，形态由圆形成长为纺锤形，这种形态变化可能取决于各部位分生组织的细胞分裂频率^［19］。光叶蕨珠芽从基部变黑直到掉落于地，成熟期将近2个月，较其他植物0.5~1个月^［5-8］的成熟期长，这期间珠芽一直为绿色，有助于通过光合作用积累糖分和干物质。多数蕨类植物珠芽表皮附着鳞片或腺毛，而光叶蕨珠芽外部光滑无鳞片，没有表皮衍生结构分化，这可能与光叶蕨身处潮湿崖岩壁有关^［20］。

光叶蕨珠芽发育过程包括启动期（珠芽原基发育及分化期）、膨大期和成熟期，各时期的解剖结构与单芽狗脊蕨（W. unigemmata）^［7］、稀子蕨^［8］等的珠芽发育过程类似。光叶蕨叶片表皮细胞分裂能力强，细胞形状与非胎生蕨类差异较大^［21］，珠芽起源于叶脉处维管束周围的薄壁细胞，是已分化的薄壁细胞重新获得分裂能力后分化而来。叶片初长成时，珠芽进入启动期，末级细脉处表皮下维管束周围的薄壁细胞恢复分裂能力，形成珠芽原基细胞团，即珠芽原基；珠芽原基不断分裂、分化，珠芽球茎不断膨大，直至基部褐化时成熟。

从光叶蕨珠芽纵切面（图2A~2D）看，上部顶端是一团原生质很浓的细胞，为芽生长锥，分化形成幼叶；下部是珠芽的营养贮存部分，含有大量贮藏物质颗粒的薄壁细胞；中央是维管组织，基部与叶片结合处的维管束相连，一直通往芽。珠芽横切面从外到内依次是表皮、薄壁组织、初生加厚分生组织、内生薄壁组织和散生在其中外韧维管束。从解剖结构上看，光叶蕨珠芽具备芽的特征，但与正常的茎上芽相比又具特殊性，即珠芽自身能贮藏大量营养物质^［3］。

3.3　珠芽繁殖方式

大多数蕨类植物的珠芽形成过程并无性器参与，也不产生性器，它是在叶轴、羽轴或叶脉处分化产生的营养芽结构，可在母体上长出须根和幼叶，落地后可长成新植株，因此，其生殖方式不属于有性生殖，属于一种营养体胎生现象^［22］。光叶蕨叶片生长到一定阶段，羽片背面的末级细脉处会分化出珠芽，它与孢子囊群同期出现同一裂片的不同细脉上，是由多个体细胞共同形成，因此，光叶蕨珠芽也是一种营养芽性质的克隆繁殖结构。光叶蕨的珠芽和孢子同期出现在同一脉序上，脉序上不仅产生有性生殖的孢子，还有部分孢子发育失利后转化的无性繁殖珠芽。上述繁殖方式构成了有性繁殖与无性繁殖有机结合的繁殖再生系统。植物繁育系统的丰富和发展，有利于种群的传播、扩散和数量增加，增强了植物对生态环境的适应能力，有利于种群繁衍、生物多样性和生态平衡、持续发展，是其长期与环境互作中形成的灵活多变的繁育策略，极大提高了繁殖成功的机会，是其能在复杂多变的环境中生存延续的重要手段^［23］。

珠芽具有个体较大、储存养分多等特点，可借助动物、昆虫、风力和流水等途径，扩大传播范围及拓展生存、繁殖和发展空间领域。珠芽的形成及萌发过程均采用了机动灵活的策略，且具有生活力高、生命力强及成苗高等优点，对于提高种群数量，促进种群形成、生物多样性及生态系统的丰富和发展均具有积极意义^［6］。通过长期观察及室内培育发现，光叶蕨每片叶多则能产生数十个珠芽，一年中有秋季和春季2个萌发期，无明显休眠期，室内自然萌发率高达90%以上，大大提高了繁殖成功率，因而珠芽是良好的无性繁殖材料。光叶蕨珠芽既保持了较高的繁殖能力，又继承了母株优良基因，这有利于植物更好地适应环境和种群扩散。

物种若面临恶劣或较为极端的环境，其正常的繁殖活动受到影响，无性繁殖频率通常会提高，产生营养性芽胞或珠芽代替有性生殖结构，与母体分离及独立生长^［3，22］。极小种群植物光叶蕨生长于近乎垂直的岩壁上，生态环境极为恶劣，孢子繁殖受到明显限制，无性繁殖则较为频繁，珠芽是有性生殖的补偿手段。但无性繁殖的传播距离非常有限，植物通常在亲本周围聚集，难以扩散，它们的外形相似，形成克隆植株或者成簇生长，加上缺乏基因分离和重组，遗传变异将会减少，往往会导致遗传多样性和适应潜力较低^［24-25］。光叶蕨的孢子繁殖十分困难，人工培育几年都未见萌发，主要依赖茎芽和珠芽无性繁殖，野外呈集群分布，几处分布点的面积均不足100 m²，其种群遗传多样性和环境适应能力较低，今后面临种群数量下降，甚至灭绝的风险。在全球气候变化与人类活动加剧的背景下，急需对现有光叶蕨种群开展就地保护和遗传拯救，加强人工育苗和野外回归，不断扩大种群数量。

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基金资助

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