土壤灭菌、AM真菌接种与氮添加对柠条根际土壤的影响

The Responses of Rhizosphere Soil of Caragana korshinskii under Soil Sterilization, AM Fungi Inoculation and N Addition

摘要

基于土壤微生物可增强植物对全球变化的适应性，研究氮沉降背景下土壤微生物对根际土壤微生境生态化学计量特征的影响，进而探明生态化学计量特征变化对根际土壤微生物养分限制的调控规律。在土壤灭菌处理（灭菌土（+S）和非灭菌土（-S））基础上，对1年生柠条（Caragana korshinskii）盆栽苗木进行2种苗木接种AM真菌处理（（接菌（+M）和未接菌（-M）），并设置氮添加处理（不施氮（CK）、低氮（LN，3 g·m^-2·a^-1）、高氮（HN， 6 g·m^-2·a^-1））。以非灭菌土未接菌条件下土壤原有微生物群落组成为基础，探究不同处理下微生境生态化学计量特征与微生物养分限制的关联性。结果如下：（1）灭菌土处理中，柠条菌根苗根际土壤中真菌相对丰度较非菌根苗在CK、LN和HN处理下分别显著提高了82.20%、25.00%和59.84%。（2）非灭菌土处理中，LN处理的柠条非菌根苗根际土壤微生物生物量碳磷比较CK处理降低了46.28%（P<0.05），而柠条菌根苗微生物生物量碳磷比较CK增加了56.76%（P<0.05）。（3）各氮添加处理下，灭菌土处理的柠条非菌根苗根际土壤与碳、氮相关土壤酶活性计量比，与碳、磷相关土壤酶活性计量比和向量长度均显著低于菌根苗（P<0.05）。（4）PLS-PM路径分析发现，微生物调控对微生物养分限制的总效应系数大于氮添加处理。综上，土壤原生菌和菌根真菌协同调节根际土壤酶化学计量比，进而增强土壤微生物养分限制对氮添加的适应。

Abstract

Based on the fact that soil microorganisms can enhance the adaptability of plants to global change， the effects of soil microorganisms on the ecological stoichiometric characteristics of rhizosphere soil microorganisms were studied under the background of nitrogen deposition， and then the regulation of changes in ecological stoichiometric characteristics on the soil microbial nutrient limitation was explored. Under the premise of soil sterilization treatment（sterilized soil（+S） and non-sterilized soil（-S））， one-year-old potted seedlings of Caragana korshinskii were inoculated in two ways（inoculation（+M） and without inoculation（-M））， and nitrogen addition treatments（no nitrogen application（CK）， low nitrogen（LN， 3 g·m^-2·a^-1）， high nitrogen（HN， 6 g·m^-2·a^-1）） were set up. Compared with the original microbial community composition in non-sterilized soil without fungus inoculation， the correlation between ecological stoichiometric characteristics of microhabitat and microbial nutrient limitation under different treatments was explored.Results were as follows： （1）In sterilized soil treatment， the relative abundance of fungi in the rhizosphere soil of C. korshinskii mycorrhizal seedlings was significantly increased by 82.20%， 25.00% and 59.84% under CK， LN and HN treatments than that of non-mycorrhizal seedlings， respectively. （2）In the treatment of non-sterilized soil， the microbial biomass carbon-to-phosphorus ratio in the rhizosphere soil of non-mycorrhizal C. korshinskii seedlings under LN treatment was lower by 46.28% compared to CK treatment（P<0.05）， while that of mycorrhizal seedlings was 56.76% higher compared to CK treatment（P<0.05）. （3）Under the nitrogen addition treatments， stoichiometry of carbon and nitrogen-related soil enzyme activity， stoichiometry of carbon and phosphorus-related soil enzyme activity， and vector length in the rhizosphere soil of C. korshinskii non-mycorrhizal seedlings under sterilized soil treatment were significantly lower than those of mycorrhizal seedlings（P<0.05）. （4）PLS-PM path analysis showed that the total effect coefficient of microbial regulation on microbial nutrient limitation was greater than that of nitrogen addition treatment. In summary， soil indigenous microorganisms and mycorrhizal fungi synergistically regulated the enzymatic stoichiometric ratio of rhizosphere soil， and enhanced the adaptation of soil microbial nutrient limitation to nitrogen addition.

Graphical abstract

关键词

柠条 / 微生物调控 / 氮添加 / 生态化学计量特征 / 微生物养分限制

Key words

Caragana korshinskii / microbial regulation / nitrogen addition / ecological stoichiometry / microbial nutrient limitation

根际是植物根系和土壤间进行信息交换、物质循环和能量流动的活跃土壤微域环境^［1］。根际土壤微生物是连接植物根系与土壤的桥梁^［2］，调节二者间的相互作用，促进根系对水分和养分的吸收，并影响根际土壤功能发挥和生态平衡^［3］。以往研究主要通过土壤灭菌处理来判断土壤微生物对苗木生长的影响，发现其对植物生长的调节存在差异。Zhou等^［4］研究发现土壤灭菌对苗木生长起积极作用，董慧等^［5］研究发现其对苗木生长无显著影响，而蒋皓天等^［6］发现其对苗木生长存在抑制作用。土壤微生物中的菌根真菌与植物形成共生关系，植物将有机物供给菌根真菌，作为交换，菌根真菌将土壤矿质营养供应植物，因此菌根真菌强烈影响植物和根际微生物间的互作^［7］。其中丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）定殖于根系后，提高植物对胁迫环境的耐受能力，改变土壤微生物群落结构^［8］，影响根际微生境养分循环^［9］。菌根真菌能够提高根际土壤酶活性^［10］，促进植物对养分的吸收^［11］，减弱苗木的养分限制^［12］，进而提高宿主植物的环境适应性和抗逆性^［13］。菌根真菌还介导植物与其他根际微生物的互作，一些根际微生物通过调节激素水平或酶活性，促进植物生长、增加必需营养元素或抑制植物病原体，进而维持生态系统的动态平衡^［14］。然而，微生物群落的功能不是独立作用，AMF和土壤原生微生物在调控土壤养分循环中存在协同和拮抗双重效应^［6，15］，同时二者相互作用受外界环境变化的影响。因此，分析土壤微生物互作关系，旨在为生物肥料应用及林业生态修复提供理论基础。

全球变化中氮沉降进入生态系统，外源氮作为一种非生物胁迫可能会打破根际原有的微生态平衡，影响土壤微生物群落结构^［16］。以往研究发现，氮沉降能够影响土壤理化性质，直接或间接地调控微生物群落结构以及微生境生态化学计量特征。Sun等^［17］研究表明，低氮（120 kg·hm^-2）和中氮（240 kg·hm^-2）输入能够提高AMF丰度，而高氮（360 kg·hm^-2）输入限制AMF功能发挥。张晓晴等^［18］研究表明，长期氮添加处理对土壤群落结构的影响较短期氮添加更为显著，也有研究表明短期氮添加处理对土壤微生物群落结构无显著影响^［19］。刘春华等^［20］研究发现，氮添加处理后，米槠（Castanopsis carlesii）根际土壤微生物生物量增加，土壤养分有效性增加，导致微生物群落结构发生改变。王岩等^［21］研究发现，土壤生态化学计量特征能够反映物质循环中的营养元素平衡及其相互关系，是评价土壤养分限制状况的重要指标。土壤有效养分化学计量比对微生物群落结构有显著影响^［22］，能够反映微生物养分限制情况^［23］。氮添加对生态化学计量特征的影响程度与氮沉降水平密切相关^［24］，且氮添加处理能够显著降低植物根际土壤微生物碳和磷的养分限制^［25-26］。以往研究多是关于微生物调控或氮添加单一因素对土壤养分平衡的影响，然而，对土壤原生菌与接种菌根真菌交互作用调节微生物养分平衡对外源氮输入的响应研究相对缺乏。因此，在氮沉降背景下，分析土壤微生物交互作用对土壤微生境化学计量平衡的调控规律，对分析全球气候变化背景下生态系统稳定性具有重要意义。

黄河流域砒砂岩区是我国北方重要的生态过渡带，同时也是我国水土流失强度最大的区域之一，是造成黄河流域“地上悬河”的粗泥沙来源区^［27］。柠条（Caragana korshinskii）对干旱环境的适应能力较强，作为土壤侵蚀生物防治的重要植被，被广泛用于中国干旱半干旱地区的植被恢复^［28］。本研究以柠条苗木为试验材料，揭示氮沉降背景下土壤原生菌和外接菌根真菌影响柠条苗木根际土壤微生境生态化学计量特征的规律。进一步探究土壤原生菌和外接菌根真菌对苗木根际土壤微生物养分限制的调控过程是协同还是拮抗效应。通过土壤微生物调控和氮添加对柠条根际微生物养分限制的影响研究，为干旱半干旱地区脆弱生态系统生态稳定性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

试验土壤采自半干旱地区内蒙古自治区鄂尔多斯市准格尔旗生态水土保持科技园区（39°46′29.62″~39°46′54.71″N，110°35′18.37″~110°36′19.95″E），属于典型的砒砂岩地质区。

柠条种子采集于内蒙古自治区呼和浩特市和林格尔县（39°58′N，112°18′E），将种子用2%的KMnO₄溶液消毒30 min，然后用去离子水洗净后用于播种。

接种的AMF菌剂为根内根孢囊霉（Rhizophagus intraradices）和摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）。AMF菌剂以紫花苜蓿（Medicago sativa）为宿主植物进行扩繁，扩繁基质为沙土（体积比为3∶1）混合物，最终的接种菌剂中包含扩繁基质、侵染根段、孢子和菌丝，菌剂中孢子密度为每g土18.7个。

1.2　试验方法

1.2.1　土壤灭菌处理

设置2种土壤灭菌处理，分别为灭菌土（+S）和非灭菌土（-S）处理。灭菌土处理是在高温高压（121 ℃，103 kPa）环境下灭菌40 min，灭活土壤微生物；非灭菌土处理保留土壤原有微生物。于2021年4月，在育苗盆（直径15 cm，高度13 cm）中分别放入灭菌土和非灭菌土，至育苗盆高度的4/5。

1.2.2　苗木接菌处理

同时设置2种苗木接菌处理，分别为混合接菌处理（+M）和未接菌处理（-M）。混合接菌处理为根内根孢囊霉和摩西斗管囊霉2种AMF菌剂等质量混合后，在土壤上平铺混合菌剂45 g；未接菌处理则加入等质量的灭活菌剂。然后，将消毒后的柠条种子播入其中，其上再覆盖一层土壤。置于内蒙古农业大学实验苗圃培养，每盆保留3株苗木。

1.2.3　氮添加处理

2021年6月开始氮添加试验，氮添加处理 参考我国中部区氮沉降量（5.16 g·m^-2·a^-1）^［29］和 试验区氮沉降量（3.43 g·m^-2·a^-1）^［30］，设置3个氮 添加处理，分别为不施氮处理（CK）、低氮处理（LN，3 g·m^-2·a^-1）、高氮处理（HN，6 g·m^-2·a^-1）。用自来水溶解的NH₄Cl和KNO₃（n（NH₄⁺）∶n（NO₃^-）为1∶1）作为氮源，每隔10 d向每盆苗木施入含氮溶液150 mL，生长季共施氮11次，各次氮施入量依据研究地生长季降雨量权重计算（见表1），采用喷洒方式将氮均匀施入育苗盆中。试验设置2种土壤灭菌处理、2种苗木接菌处理和3种氮添加处理，共计12种处理组合，各处理组合分别培育 15盆苗木，每盆3株，共计540株苗木。

1.3　土壤样品采集及其化学指标测定

1.3.1　土壤样品采集

2021年9月中旬，12种处理中各取15株苗木，采用抖落法采集根际土壤样品，将各土壤样品分为3份：一份-40 ℃冻存，用于测定磷脂脂肪酸含量；一份4 ℃冷藏，用于测定土壤微生物生物量和酶活性；一份自然风干，用于测定土壤养分含量。

1.3.2　土壤化学指标测定

（1）土壤微生物群落结构分析

采用磷脂脂肪酸（PLFA）技术，用气相色谱仪（Agilent 7890A，美国）进行测定^［31］。

土壤微生物相对丰度计算公式：

\mathrm{细菌}\mathrm{相对}\mathrm{丰度}=\frac{\mathrm{革兰}\mathrm{氏阳}\mathrm{性菌}+\mathrm{革兰}\mathrm{氏阴}\mathrm{性菌}+\mathrm{厌氧}\mathrm{菌}}{\mathrm{放线}\mathrm{菌}+\mathrm{革兰}\mathrm{氏阳}\mathrm{性菌}+\mathrm{革兰}\mathrm{氏阴}\mathrm{性菌}+\mathrm{厌氧}\mathrm{菌}+\mathrm{丛枝}\mathrm{菌根}\mathrm{真菌}+\mathrm{其他}\mathrm{真菌}}\times \mathrm{100}\%

\mathrm{真菌}\mathrm{相对}\mathrm{丰度}=\frac{\mathrm{丛枝}\mathrm{菌根}\mathrm{真菌}+\mathrm{其他}\mathrm{真菌}}{\mathrm{放线}\mathrm{菌}+\mathrm{革兰}\mathrm{氏阳}\mathrm{性菌}+\mathrm{革兰}\mathrm{氏阴}\mathrm{性菌}+\mathrm{厌氧}\mathrm{菌}+\mathrm{丛枝}\mathrm{菌根}\mathrm{真菌}+\mathrm{其他}\mathrm{真菌}}\times \mathrm{100}\%

（2）土壤微生物生物量碳、氮和磷测定

采用氯仿熏蒸浸提，微生物生物量碳和氮采用TOC自动分析仪（Elementer luqui TOCII，德国）测定，微生物生物量磷采用比色法测定^［32］。

（3）土壤有效养分指标测定

土壤溶解性有机碳（Dissolved organic carbon，D_OC）使用TOC自动分析仪测定；土壤有效氮（Available nitrogen，A_N）（铵态氮和硝态氮）使用连续流动分析仪（BRAN+LUEBBE-AA3，德国）测定；土壤有效磷（Available phosphorus，A_P）采用钼锑抗比色法测定^［26］。

（4）土壤酶活性指标测定

根据Sinsabaugh等^［33］方法，选取对硝基苯- β-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯磷酸二钠、对硝基苯β-N-乙酰葡糖胺糖苷和L-亮氨酸-4-硝基苯胺为反应底物，比色测定β-1，4-葡萄糖苷酶（β-1，4-Glucosidase，BG）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、β-1，4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（β-1，4-N-Acetylglucosaminidase，NAG）、亮氨酸氨基肽酶（Leucine arylamidase，LAP）活性。

酶化学计量特征计算公式：

E_{\mathrm{C}}:E_{\mathrm{N}}=\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{B}\mathrm{G})/\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{L}\mathrm{A}\mathrm{P}+\mathrm{N}\mathrm{A}\mathrm{G})（1）

E_{\mathrm{C}}:E_{\mathrm{P}}=\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{B}\mathrm{G})/\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{A}\mathrm{L}\mathrm{P})（2）

E_{\mathrm{N}}:E_{\mathrm{P}}=\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{L}\mathrm{A}\mathrm{P}+\mathrm{N}\mathrm{A}\mathrm{G})/\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{A}\mathrm{L}\mathrm{P})（3）

V_{\mathrm{L}}=\sqrt[]{[\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{B}\mathrm{G})/\mathrm{l}\mathrm{n}{(\mathrm{L}\mathrm{A}\mathrm{P}+\mathrm{N}\mathrm{A}\mathrm{G})]}^{\mathrm{2}}+[\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{B}\mathrm{G})/\mathrm{l}\mathrm{n}{(\mathrm{A}\mathrm{L}\mathrm{P})]}^{\mathrm{2}}}（4）

V_A=Degrees｛ATAN2［ln（BG）/ln（ALP），ln（BG）/ln（LAP+NAG）］｝（5）

式中：E_C∶E_N、E_C∶E_P、E_N∶E_P分别为与碳、氮和磷转化相关的土壤水解酶活性自然对数（ln）转化后的比值；V_L为向量长度，相对较长的向量长度表示更大的微生物相对碳限制；V_A为向量角度，向量角度>45°表示微生物相对磷限制，向量角度<45°表示微生物相对氮限制^[34]。

1.4　数据处理

利用SPSS 23.0对土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理进行单因素方差分析和三因素交互作用分析，采用LSD多重比较法检验不同处理下柠条根际土壤生态化学计量比的差异显著性。采用偏最小二乘路径模型（PLS-PM）确定根际土壤生态化学计量特征对微生物代谢限制影响的潜在途径，使用R语言（4.0.2）中的“plspm”包构建路径模型，并采用Sigmaplot 12.5软件作图。

2 结果与分析

2.1　土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理对柠条苗木根际土壤微生物相对丰度的影响

土壤灭菌和苗木接菌处理显著影响柠条苗木根际土壤微生物相对丰度（P<0.01），而氮添加处理只对柠条苗木根际土壤真菌相对丰度有影响 （P<0.05）（见图1）。氮添加处理下，微生物调节作用中柠条根际土壤真菌相对丰度由高到低顺序均为灭菌土处理的菌根苗（+S+M）、非灭菌土处理的菌根苗（-S+M）、灭菌土处理的非菌根苗（+S-M）、非灭菌土处理的非菌根苗（-S-M）；而微生物调节作用中柠条根际土壤细菌相对丰度与土壤真菌相反。+S处理下，+M处理的柠条根际土壤中真菌相对丰度均显著高于-M处理；而+M处理下，土壤灭菌处理之间均无显著差异。除+S+M处理外，LN和HN处理均较CK处理提高了柠条苗木根际土壤中真菌相对丰度。CK条件下，-S-M处理的柠条苗木根际土壤细菌相对丰度达到最大，而真菌相对丰度最小。

2.2　土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理对柠条苗木根际土壤微生物生物量及其化学计量特征的影响

土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理交互作用显著影响柠条苗木根际土壤微生物生物量碳（M_BC）（P<0.05）、氮（M_BN）（P<0.01）含量以及微生物生物量碳磷比（M_BC∶M_BP）（P<0.001），而对柠条苗木根际土壤微生物生物量磷（M_BP）含量、微生物生物量碳氮比（M_BC∶M_BN）和微生物生物量氮磷比 （M_BN∶M_BP）无显著影响（P>0.05）（见表2）。-M处理下，+S处理的柠条苗木根际土壤M_BC和M_BN显著低于-S处理。随着氮添加量的增加，+M处理的柠条苗木根际土壤M_BC显著升高。除-S+M处理外，LN和HN处理的柠条苗木根际土壤M_BN均大于CK处理，而M_BC∶M_BN均小于CK处理。-M处理的柠条苗木根际土壤M_BC∶M_BP在LN和HN处理下低于CK处理，而+M处理的柠条苗木根际土壤M_BC∶M_BP在LN处理下高于CK处理。+S处理下，LN和HN处理的柠条苗木根际土壤M_BN∶M_BP均大于CK处理；-S处理下，LN和HN处理的柠条苗木根际土壤M_BN∶M_BP均显著小于CK处理。氮添加处理下，-S-M处理的苗木根际土壤M_BN∶M_BP均显著高于+S-M处理，分别提高了810.47%、195.69%和582.95%。

2.3　土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理对柠条苗木根际土壤酶及其化学计量特征的影响

土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理交互作用显著影响柠条苗木根际土壤碳相关酶活性（E_C） （P<0.05）、磷相关酶活性（E_P）（P<0.01）、碳氮养分转化相关酶活性比（E_C∶E_N）（P<0.05）、氮磷养分转化相关酶活性比（E_N∶E_P）（P<0.001）和向量角度（V_A）（P<0.001）（见表3）。+S处理的柠条根际土壤E_C、E_N和E_P显著低于-S处理。CK处理的柠条根际土壤E_P均低于LN和HN处理。各氮添加处理下，除+S-M处理外，其他处理的碳氮磷养分转化相关酶活性比（E_C∶E_N∶E_P）均为1∶1∶1。CK条件下，+S-M处理的柠条苗木V_A>45°，且根际土壤E_N和E_N∶E_P低于其他处理，与LN和HN相比，分别显著降低了69.21%和61.96%、36.23%和32.82%。CK条件下，+S-M处理的柠条苗木根际土壤E_N∶E_P最小，而V_A达到最大值。CK条件下，-S-M处理的柠条苗木根际土壤E_C∶E_N、E_C∶E_P和V_L达到最大值；-S+M处理的E_N∶E_P达到最大值且V_A达到最小值。V_L的最大值和V_A的最小值均在-S处理下达到。各氮添加处理下，+M处理的柠条苗木根际土壤E_C∶E_N、E_C∶E_P和V_L无显著变化。各氮添加处理下，+S-M处理的柠条根际土壤E_C∶E_N、E_C∶E_P和V_L显著低于其他处理。随着氮添加量的增加，-S-M处理的柠条苗木根际土壤E_C∶E_N、E_C∶E_P和V_L均呈下降趋势。+S+M和-S-M处理中，柠条苗木根际土壤V_A均呈先增加后降低的趋势，并在LN处理下达到最大。-S+M处理中，柠条苗木根际土壤V_A呈上升趋势。

2.4　土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理对柠条苗木根际土壤养分及其计量特征的影响

土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理交互作用显著影响柠条苗木根际土壤有效磷（A_P）含量（P<0.001）、可溶性有机碳∶有效氮（D_OC∶A_N）（P<0.05）、可溶性有机碳∶有效磷（D_OC∶A_P）（P<0.01）和有效氮∶有效磷（A_N∶A_P）（P<0.05）（见表4）。-S+M处理的柠条根际土壤D_OC显著高于其他处理。土壤灭菌处理下，柠条菌根苗根际土壤A_N均小于非菌根苗，且D_OC∶A_N均大于非菌根苗。除-S+M处理外，LN和HN处理下的柠条根际土壤D_OC和D_OC∶A_N均低于CK处理。+S-M处理的柠条苗木根际土壤A_N和A_N∶A_P均显著大于其他处理。随着氮添加量增加，+M处理的柠条苗木根际土壤D_OC∶A_P呈先下降后上升的趋势，在LN处理下达到最小值。-S+M处理的柠条苗木根际土壤D_OC∶A_N和D_OC∶A_P达到最大值。

2.5　微生物养分限制与生态化学计量特征的关系

利用PLS-PM路径模型分析微生物调控、氮添加处理、微生物生物量化学计量比、酶化学计量比和有效养分化学计量比对微生物养分限制的影响，路径分析的拟合度为0.71（见图2）。氮添加处理对微生物养分限制的直接效应为负效应（路径系数为-0.17）。微生物调控通过影响微生物生物量化学计量比和酶化学计量比，进而负效应作用于微生物养分限制，其中微生物极显著调控（路径系数为0.56）影响酶化学计量比，进而最大限度地负向调节酶化学计量比（路径系数为-0.64）对微生物养分限制的影响（见图2）。影响微生物养分限制各因子的总效应分析表明，微生物调控的总效应大于氮添加处理，酶化学计量比是微生物调控影响微生物养分限制的重要途径（见图3）。

3 讨论

3.1　土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理对柠条苗木根际土壤化学计量特征的影响

土壤微生物调节和外源氮输入均对根际土壤化学计量平衡和生态系统稳定有重要的影响^［35］。外源氮输入后，柠条非菌根苗M_BC∶M_BN和M_BC∶M_BP均降低（见表2），其原因可能是未接种AMF制约菌根共生体形成，限制了植物与微生物间的养分循环^［7］，而外源氮输入在一定程度上满足氮的供应，改善了微生物活性，提高了微生物氮和磷的养分利用率^［36］。外源氮输入后，非灭菌土处理的柠条苗木根际土壤M_BN∶M_BP较不施氮处理均减小，进一步证明氮添加处理满足了根际土壤氮养分供应时，土壤微生物需要提高相对更高的磷养分利用效率，来维持微生物养分供需平衡^［37］。以往研究发现苗木根际土壤酶活性变化规律直接反映根际土壤微生物对养分的需求^［38］，同时土壤酶化学计量能够较好地表征微生物对碳、氮和磷的相对养分需求情况^［39］。

在全球尺度上，土壤酶化学计量C∶N∶P为1∶1∶1，表征生态系统养分平衡^［40］。本研究发现，灭菌土处理结合苗木未接菌处理下表现为养分不平衡，而非灭菌土和苗木接菌的单一处理和协同作用下，均有利于柠条根际土壤中碳氮磷养分平衡（见表3），表明土壤原生菌和菌根真菌均有利于维持根际土壤养分循环趋于稳态。结合无土壤微生物作用下，柠条苗木根际土壤A_N含量和A_N∶A_P显著大于其他处理（见表4），进一步说明无微生物条件严重影响了氮元素循环过程，原因可能为土壤氮无微生物作用下循环减慢^［41］。结合本研究中土壤有效养分计量比发现，D_OC∶A_N和D_OC∶A_P在非灭菌土处理的柠条菌根苗根际土壤中达到最大，进一步验证了土壤原生微生物和菌根真菌的互作关系，其中D_OC含量增加（见表4）的原因可能是土壤原生菌和外接菌根真菌协同效应增强了植物对外源氮输入的适应性，提高了植物净光合能力^［42］，进而提高了植物D_OC释放速率^［43］。

氮添加处理对柠条菌根苗根际土壤E_C∶E_N、 E_C∶E_P无显著影响（见表3），表明接种丛枝菌根真菌有利于维持土壤酶化学计量的平衡关系，原因可能是接菌处理中菌根真菌与植物共生，显著提高了柠条根际土壤中真菌的相对丰度（见图1），使柠条苗木根际土壤微生物群落结构得到优化^［44］，进而提高了根际微生态环境的稳定性^［41］。而土壤灭菌处理对柠条苗木根际土壤微生物相对丰度影响较小（见图1），可能是因为随着苗木生长过程中通过根系招募残留的微生物，导致一定程度上的土壤微生物群落恢复^［45］。以往研究^［46］表明，土壤微生物相对丰度与生态环境密切相关。本研究中，苗木接菌和氮添加处理均有利于增加真菌的相对丰度，表明苗木接菌和氮添加处理均有利于真菌富集，进而发挥其在植物根系与细菌间的介导作用，增强根际土壤微生态环境的稳定性^［14］。

3.2　土壤灭菌、苗木接菌和氮添加处理对柠条苗木根际土壤微生物养分限制的影响

土壤微生物养分限制程度在调节微生态环境平衡过程中具有重要作用，且易受到外界环境变化的影响^［47］。本研究发现，灭菌土处理的柠条非菌根苗根际土壤E_C∶E_N、E_C∶E_P和V_L均显著低于其他处理（见表3），表明灭菌土处理的柠条非菌根苗根际土壤相对碳限制较弱。原因可能是水解酶属于积累酶，高温高压处理使土壤酶活性被破坏，土壤酶活性降低（见表3），导致养分限制减弱，虽然随着苗木生长其根际土壤酶活性逐渐恢复，但短时间内无法达到其他处理的水平^［48］。也可能是最初无土壤微生物，使养分循环过程受阻，弱化了微生物间的养分竞争，而后期微生物招募需要一定时间，导致了微生物间养分限制较低^［49］。本研究还发现，微生物相对碳限制和氮限制最强出现在非灭菌土处理中，表明最初存在土壤原生菌条件下，无菌根真菌作为介导调节，导致微生物相对碳氮限制增加。

土壤微生物养分限制除了受土壤微生物直接影响外，也可能通过调节胞外酶活性，进而影响微生物养分限制^［50］。本研究发现，随着氮施入量的增加，灭菌土处理下的柠条非菌根苗根际土壤 E_N∶E_P显著增大，V_A显著减小且低于45°（见表3），表明微生物从相对磷限制转化为相对氮限制^［51］，可能是由于灭菌土和苗木未接菌导致土壤养分转化酶活性均较低；另外，碱性土中磷元素易被固定，导致微生物相对磷限制强烈^［47］。低氮处理下，除灭菌土处理的柠条非菌根苗外，其他处理的柠条苗木根际土壤V_A均增大，氮限制减弱；高氮处理下，只有非灭菌土处理的柠条菌根苗V_A继续增大，氮限制持续减弱，原因可能是与无土壤微生物相比，土壤原生菌和菌根真菌单一条件均能在一定程度上调节苗木对氮输入的适应能力，而接菌处理能够在土壤原生菌的基础上进一步增强苗木对养分的吸收^［11］，有助于苗木根际土壤养分转化^［52］，增强苗木对氮输入的适应能力^［53］，导致根际微生物相对氮限制减弱。

通过PLS-PM路径模型分析发现，微生物养分限制的影响因素中，微生物调控对微生物养分限制产生主要影响，且主要通过调节土壤酶化学计量特征影响微生物养分限制（见图3），原因可能是有效养分无法满足微生物生长需求，会影响养分相关酶活性，进而作用于微生物养分限制。参考生态经济学的“最优配置”原则，本研究中也发现，A_N∶A_P的最大值和E_N∶E_P的最小值同时出现在灭菌土处理的柠条非菌根苗中，而A_N∶A_P的最小值和E_N∶E_P的最大值同时出现在灭菌土处理的柠条菌根苗中，原因是养分氮含量相较于磷含量充足时，氮相关酶活性减弱，氮限制减弱，该结果验证了土壤胞外酶被优先分泌来获取相对限制强烈的养分^［9］。

4 结论

土壤原生菌和菌根真菌通过调节根际土壤酶化学计量比，促进柠条根际土壤中碳氮磷养分平衡。随着氮输入量的增加，土壤原生菌和菌根真菌能够协同调控土壤微生物养分限制对氮添加的适应，增强根际生态环境稳定性。今后研究可以进一步分析微生态环境中的微生物群落结构多样性和丰富度，细化微生物互作调控机制。

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基金资助

内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY22527)

内蒙古农业大学青年教师科研能力提升专项(BR220136)

内蒙古自治区科技计划项目(2022YFDZ0030)

呼和浩特市重大科技专项（2022-社-重-4-2）