基于SRAP分子标记的郁金香遗传多样性分析

Genetic Diversity Analysis of Tulip Based on SRAP Markers

摘要

为探究郁金香（Tulipa gesneriana）种质资源的遗传背景，精准评价和筛选优异种质用于郁金香遗传改良，该研究采用SRAP分子标记分析40个郁金香品种的遗传背景，明晰遗传多样性和亲缘关系。结果表明：在43对SRAP引物中可用于郁金香遗传多样性研究的多态性引物共21对，在40个品种中共扩增出249条清晰稳定的条带，其中多态性条带245条，多态性比率为98.39%。供试的40个品种遗传相似性指数为0.502 0~0.867 5，遗传多样性参数等位基因数（N_{\mathrm{a}}^{\mathrm{*}}）、有效等位基因数（N_{\mathrm{e}}^{\mathrm{*}}）、Nei’s基因多样性指数（H^*）、Shannon’s信息指数（I^*）和多态性信息含量分别为1.981 0、1.514 9、0.304 2、0.460 3和0.321 2，供试材料遗传多样性丰富。聚类结果和主坐标分析将40个郁金香品种分为两大类，其中‘Christmas Magical’‘Banja Luka’‘Madame Lefeber’与其他品种亲缘关系较远，在遗传背景上具有一定差异。

Abstract

In order to explore the genetic background of tulip germplasm resources， accurately evaluate and screen excellent germplasm for genetic improvement of tulips， the genetic background of 40 tulip varieties was analyzed by SRAP molecular markers， and their genetic diversity and relationships were clarified， respectively. The results showed that out of 43 pairs of SRAP primers， 21 pairs of polymorphic primers were available for genetic diversity analysis of tulips， and 249 clear and stable bands were amplified in the 40 tulip varieties， of which 245 were polymorphic bands with a polymorphism rate of 98.39%. The genetic similarity index of the 40 tested varieties ranged from 0.502 0 to 0.867 5， and the genetic diversity parameters including the number of alleles（N_{\mathrm{a}}^{\mathrm{*}}）， number of effective alleles（N_{\mathrm{e}}^{\mathrm{*}}）， Nei’s gene diversity index（H^*）， Shannon’s information index（I^*）， and polymorphic information content were 1.981 0， 1.514 9， 0.304 2， 0.460 3， and 0.321 2， resp-ectively， indicating rich genetic diversity in the tested materials. Cluster analysis and principal coordinate analysis showed that the 40 tulip varieties were classified into two major groups， among which ‘Christmas Magical’， ‘Banja Luka’， and ‘Madame Lefeber’ were relatively distant genetic relationships from other varieties and had certain differences in their genetic backgrounds.

Graphical abstract

关键词

郁金香 / SRAP / 遗传多样性 / 聚类分析

Key words

Tulipa gesneriana L. / SRAP markers / genetic diversity / cluster analysis

郁金香（Tulipa gesneriana）为百合科（Liliaceae）郁金香属（Tulipa）植物，是世界上最重要的观赏植物之一^［1］。起源于中亚的帕米尔阿莱山脉和天山山脉，栖息地从南欧、北非、安纳托利亚和伊朗一直延伸到中国的西北部。由于其花色丰富、花期长、香味宜人，已被广泛用于切花、盆栽植物和园林绿化，具有重要的经济、园艺、美学、生态、保护和药用价值^［2］。同时在世界上许多地区也具有重要的文化意义，是土耳其、荷兰、伊朗等国家的国花^［3］。

目前，郁金香有102个类群，超过6 700个品种，绝大多数为杂交品种。由于其杂合度高，后代形态特征非常丰富，使得传统的形态学分类已不能满足系统分类的要求^［4］。郁金香大多数品种为 二倍体（2n=2x=24），部分品种为三倍体（2n=3x=36），同时存在部分的四倍体（2n=4x=48）、五倍体（2n=5x=60）和六倍体（2n=6x=72）品种^［5］，因此倍性育种将会在郁金香育种工作中发挥重要作用。相关研究表明，不同郁金香品种在染色体类型、核型对称程度、含有随体的染色体数量和染色体臂长上存在不同程度的变化^［6］。在现代植物育种中，具有广泛变异的本地植物被认为是杂交育种中有价值的基因库^［7］。我国虽然拥有丰富的野生郁金香资源，但郁金香育种工作仍处于起步阶段。野生郁金香资源对环境适应性强，具有栽培品种不具有的优良性状基因。丰富的遗传多样性使植物能够生存并适应环境变化，是植物遗传资源保护的一个重要目标^［8］。因此，了解郁金香遗传多样性是制定郁金香育种计划、种群鉴定与分类的必要前提。

目前，郁金香基因组信息相对匮乏，在NCBI、Genebank数据库中与郁金香相关的有1 900条碱基序列、4 858条蛋白序列。随着分子生物学技术的发展，分子标记技术因方法相对简便，多态性高且不受生长环境影响等优点，成为目前种质资源鉴定的高效技术手段，使短期内实现新品种的选育成为可能^［9］。相关序列扩增多态性（Sequence-related amplified polymorphism， SRAP）是一种基于PCR的新型分子标记技术，以复性变温法为核心，特定引物开放阅读框^［10］，具有操作过程简单、扩增条带清晰、结果稳定、重复性高等特点^［11］，已广泛用于莱豆（Phaseolus lunatus）^［12］、睡莲属（Nymphaea）^［13］等多种植物种质资源鉴定、重要性状标记、遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究中。目前，已有多种分子标记，如ISSR、SNP和EST-SSR^［14］等应用于郁金香遗传多样性的研究，而SRAP分子标记在郁金香相关研究中鲜见报道。通过不同的分子标记可丰富郁金香在分子水平上的遗传背景信息，对郁金香属植物种群演化研究具有重要意义。本研究旨在利用SRAP分子标记探究40个郁金香品种的遗传多样性，为郁金香种质资源筛选、亲缘关系分析和育种计划提供理论基础。

1 材料与方法

1.1　试验材料

供试的40个郁金香品种购于北京圃朗特园艺有限公司，均为荷兰进口种球（表1）。各品种均选择饱满、均匀且无病害的种球种植在青海大学高原花卉研究中心郁金香种质资源圃（36°43′38″N，101°44′39″E，海拔2 260 m），年平均日照时间 1 939.7 h，年平均温度5.7 ℃，年平均降水量373 mm。于展叶期剪取各品种的嫩叶进行编号、表面消毒，于冰箱中-80 ℃保存备用。

1.2　DNA提取及检测

采用改良的CTAB法提取总DNA，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪（OSE-260，北京）对各供试材料的总基因组DNA的质量和浓度进行检测，检测合格的DNA均稀释至80 ng·μL^-1后于-20℃保存备用。

1.3　引物筛选和SRAP-PCR扩增

根据扩增条带的清晰度、稳定性和亮度，从43对SRAP候选引物组合中^［15］，筛选适用于本研究的最佳引物（表2）。PCR扩增体系为20 μL体系，包括：2.0 mmol·L^-1 Mg²⁺ 1.6 μL，0.2 mmol·L^-1 dNTPs 1.6 μL，1.5 U·μL^-1Taq DNA酶6 μL，0.2 µmol·L^-1上下引物各0.4 μL，80 ng·μL^-1 DNA模板1 μL，10×PCR buffer 2 μL，最后用ddH₂O 7.3 μL补足 20 μL体系。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；35 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min， 5个循环后结束。94 ℃变性1 min；50.5 ℃退火 1 min；72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR扩增产物，用含Gold View Ⅰ型核酸染色剂（按体积比1∶10 000稀释）的1%琼脂糖凝胶电泳检测，并以5 μL DNA marker DL2000作为大小及浓度对照，使用紫外凝胶成像仪观察并拍照留存。

1.4　数据处理与分析

根据SRAP扩增结果，按扩增条带的有无记录各引物的扩增产物，有清晰条带的记为“1”，相同位置无条带的记为“0”，制成Excel表格构建原始数据矩阵保存数据。将构成“0”和“1”的二元数据表格导入POPGENE 32软件进行统计分析：计算多态位点百分率、等位基因数（N_a*）、有效等位基因数（N_e*）、Nei’s基因多样性指数（H*）、Shannon’s信息指数（I*）、多态性信息含量；运用NTSYS 2.10e软件得到品种间的遗传相似系数并根据数据结果进行非加权组平均法（UPGMA）聚类分析，获得聚类图；利用PAST 3.11软件进行主成分分析，绘制PCoA图；利用Tbtools 2.056软件绘制供试材料的相关性热图。

2 结果与分析

2.1　引物筛选及SRAP-PCR扩增多态性

在43对引物中共获得21对具有多态性条带的SRAP引物（图1），可用于供试材料的SRAP-PCR扩增，分别为Em1-Me3、Em1-Me4、Em1-Me5、Em1-Me6、Em1-Me7、Em3-Me7、Em4-Me1、Em4-Me10、Em5-Me5、Em5-Me9、Em5-Me10、Em6-Me3、Em6-Me7、Em7-Me2、Em7-Me3、Em9-Me6、Em9-Me7、Em9-Me8、Em10-Me5、Em10-Me6、Em10-Me8。

利用21对SRAP引物组合分别对40个郁金香品种进行SRAP-PCR扩增（表3），共得到249条条带，其中多态性条带数为245条，多态性比率为98.39%，说明SRAP分子标记适用于供试材料的遗传多样性分析并具有丰富的多态性，供试材料的遗传变异水平较高，对环境的适应能力较强。21对引物扩增的多态性比率为86%~100%，有17对引物的多态性比率达到100%，每对引物可扩增出的条带数量为6~23条，平均为11.9条，其中Em1-Me6扩增的条带最多，为23条；Em1-Me6、Em7-Me2、Em5-Me9、Em10-Me5、Em9-Me7、Em10-Me8扩增条带数量达14条以上；Em4-Me1扩增条数量最少为6条。

2.2　遗传多样性分析

40个供试品种的遗传多样性参数中（表4），等位基因数（N_{\mathrm{a}}^{\mathrm{*}}）为1.857 1~2.000 0，平均为1.981 0；有效等位基因数（N_{\mathrm{e}}^{\mathrm{*}}）为1.326 1~1.616 0，平均为1.514 9；Nei’s基因多样性指数（H^*）为0.210 6~0.406 1，平均为0.304 2；Shannon’s信息指数（I^*）为0.333 3~0.593 0，平均为0.460 3；多态性信息含量平均为0.321 2，分布在0.210 6~0.491 5，供试品种的遗传差异较为明显，遗传多样性丰富。

2.3　遗传相似系数分析

40个供试品种的遗传相似系数在0.502 0~0.867 5，表明各品种在SRAP分子标记水平上变异幅度较大（图2）。‘Sweet Prince’与‘Purple Prince’之间的遗传相似系数最高（0.867 5），品种间亲缘关系最近；‘Christmas Magical’与‘Madame Lefeber’之间的遗传相似系数最小为0.502 0，品种间亲缘关系最远，遗传差异最大。

2.4　聚类分析

UPGMA聚类树状图将40个供试品种在阈值为0.590处聚为A和B两大类（图3），A大类共有38个品种，在阈值为0.628处有37个品种聚为亚类A1，而 ‘Madame Lefeber’被单独分为亚类A2。在A1亚类中‘Sweet Prince’和‘Purple Prince’聚在一起，在表型性状上均为紫色的中花品种，表明品种间可能具有相似的亲本来源。B大类仅2个品种，分别为‘Banja Luka’和‘Christmas Magical’，属于2个不同花色的中花品种，因与其他品种的遗传相似系数较低被单独分出，说明与供试的多数品种具有一定的遗传背景差异。聚类结果说明供试的大部分栽培品种之间亲缘关系较近。

2.5　主坐标分析

利用主坐标分析（PCoA）判断供试品种间的差异（图4），‘Banja Luka’和‘Christmas Magical’与其他品种在空间上相距较远，与UPGMA聚类结果表现一致。其余38个郁金香品种在同一置信椭圆内，其中‘Madame Lefeber’‘Carola’‘Peking’与其他品种有一定的空间距离，说明在遗传背景上与其他品种具有差异；而‘Sweet Prince’和‘Purple Prince’个体距离存在重叠，证明2个品种遗传背景相似，支持聚类结果。

3 讨论

3.1　郁金香遗传多样性分析

遗传多样性是生物多样性的核心，是物种保持进化潜能的基本条件，也是优良品种选育的主要依据^［16］。遗传多样性的发生取决于种群内部和种群之间存在的可遗传变异，主要由于DNA核苷酸序列的遗传变异、染色体突变和有性生殖过程中的重组，遗传多样性高的种群对栖息地丧失和环境变化的适应能力更强^［17］。因此，了解不同物种的遗传多样性是植物改良遗传资源的基础，同时也是种群鉴定与分类、生物多样性保护等方面的基础。本研究采用SRAP分子标记研究郁金香遗传多样性，得到的多态性比率为98.39%，高于辣木（Moringa spp.）（多态位点百分率为62.50%）^［18］、流苏树（Chionanthus retusus）（多态位点百分率为95.43%）^［19］等多数植物，说明郁金香遗传多样性丰富。

有效等位基因数及遗传多样性指数是评价物种遗传变异的可靠指标。本研究中供试郁金香的有效等位基因数（N_{\mathrm{e}}^{\mathrm{*}}）为1.326 1~1.616 0，平均为1.514 9，Nei’s基因多样性指数（H^*）平均为0.304 2，Shannon’s信息指数（I^*）平均为0.460 3，相比于辣木（H^*=0.263 2、I^*=0.379 7）、流苏树（H^*=0.153 7、I^*=0.268 0）表现出较高的遗传多样性。而一个物种遗传多样性越高，对环境变化的适应能力就越强。对草本植物群落的研究^［20］发现，遗传多样性的提高可以降低物种间竞争强度，从而改变植物物种多样性与植物生产力之间的关系。本研究中，‘Banja Luka’和‘Christmas Magical’与其他品种具有较远的遗传距离，将其作为关键的育种材料，为增加郁金香遗传多样性提供可能。此外，丰富的野生郁金香是形成郁金香新种质的优异资源，在分子水平开展野生郁金香种间、种内遗传变异分析，可为野生郁金香资源保护提供理论参考。

3.2　不同分子标记的适用性

随着DNA技术的进步，诊断性分子标记更广泛地用于分子水平的植物分类、品种鉴定和植物标记辅助选择^［21］。利用不同分子标记方法对物种的遗传多样性进行分析，可以获得大量的多态性条带，非常有利于对物种进行更深入、更准确的研究。目前应用于郁金香种质资源研究的标记有RAPD标记、ISSR标记、SSR标记和SNP标记等。RAPD分子标记扩增条带多态性较低，在郁金香栽培群体内部无多态性片段且Nei’s基因多样性（H^*）和Shannon’s信息指数（I^*）为0，表明基于遗传多样性分析的数据间的比较具有一定的局限性，不能较好地区分部分品种间的亲缘关系^［22］。ISSR分子标记扩增条带多态性在90%以上且能有效区分各品种间亲缘关系^［23］。SSR分子标记在揭示郁金香种质资源分类演化方面具有较强的鉴别能力，同时具有引物廉价、通用性好、条带清晰和容易统计等优点^［24］。SNP分子标记在郁金香杂交种鉴定方面有很好的表现，但SNP标记的来源也会影响T. gesneriana和T. fosteriana品种鉴定^［25］。SRAP分子标记具有操作简便、扩增片段多态性高、重复性好，且在不同物种中具有通用性^［26］，能有效弥补RAPD、ISSR和SNP分子标记分析郁金香遗传多样性时出现的栽培群体内部无多态性片段、引物不具有通用性和部分类群无法鉴定的不足。本研究利用SRAP分子标记在供试品种中筛选到21对扩增效率高、多态性好的SRAP引物，可应用于后续的相关研究，为有效开展分子水平的郁金香遗传多样性研究提供技术支撑。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31660582)

中国科学院2021年度“西部之光”人才培养计划项目(中科人字［2022］4号)